农杆菌介导的CaRLK基因转化番茄的研究.pdf

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1、万方数据Agrobacterium——MediatedtransformationofC舭KGeneintoTomatoThesissubmittedtoOj'ngdaoAg，icultureUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofScienceWangJinlu(CollegeofLifeSciences)Supervisor：ZhaoMeiaiQingdao．ChinaJune．2012万方数据学位论文独创性声明

2、IUlIIIIIlUIIY2663366本人声明所呈交的学位论文是本人

3、在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。如不实，本人负全部责任。学位论文作者签名：王金泵签字日期：加垃年7月z日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论

4、文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：王金隶导师签字：签字日期：如f)年7月二日签字日期：切，上年夕月龃万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要农杆菌介导的CaRLK基因转化番茄的研究摘要番h$(LycopersiconesculentumMill)是一种世界性农作物，但番茄抗逆性差、易感病虫害，尤其是细菌性青枯病，严重影响其产量和质量。本研究目的是利用农杆菌介导法将CaRLK基因转入番茄抗线虫自交系P88中，获得转基因植株，为筛选出具有多重抗性的转基因番茄新品系奠定基础。主要研究结果如下：1、优化了农杆菌介导的番茄遗传转化体系，获得了阳性转基因植株。以生长8．10天

5、的生长健壮的P88幼苗的子叶、下胚轴为外植体，对番茄遗传转化条件进行了研究。对适宜的Hyg浓度进行筛选试验(设计0，2，5，10，15，20mg／L)，最终确定Hyg的筛选压为5mg／L。研究了不同预培养时间(0，12，24h)、侵染时间(5，10，15，20min)、共培养时间(O，1，2，3d)对遗传转化的影响。结果表明，外植体在预培养培养基(液体MS+10mg／LZT)上预培养12d，在农杆菌中侵染15min，共培养培养基(MS+2．Omg／LZT+O．2mg／LI从)上共培养2d，然后转移到筛选培养基(MS+2．Omg／LZT+O．2mg／LIAA+5．0mg

6、／LHyg+250mg／LCef)中进行筛选培养，为最佳的遗传转化条件。经PCI乙良应，扩增出了529bp特异性片段，即获得了P88的转基因植株。将获得的9株转基因植株，驯化培养后获得转基因种子，转化率为15．5％。2、T】代转基因植株形态学分析及分子生物学检测驯化移栽T，代植株，对其进行形态学分析。研究结果发现：转基因番茄植株在生长过程中表现出与普通植株不同的性状，如：转基因植株叶片变小、主茎与侧茎之间夹角小于45。等，这种夹角变小的现象可能是由于外源基因的导入造成的。不论初生叶型大小，番茄植株长大以后恢复正常。转基因果实与普通果实形态上没有差异。利用改良的CTAB

7、法，提取T1代植株DNA进行PCR扩增；利用Trizol试剂提取Tl代植株RNA，对其进行RT．PCR反应。结果表明：T1代植株PCR扩增后扩增出与目的基因大小片段相同529bp的条带，这表明该基因稳定的遗传给T1代；对T1代植株进行RT．PCR,结果发现，只有2号植株出现与目的基因片段大小相同的条带，这说明该基因已转入2号植物体内并表达。3、T2代转基因植株形态学分析分子、生物学分析及功能验证驯化移栽T2代植株，对其进行形态学分析。T2代植株同样表现出与T1代相类似的现象，尤其是主茎与侧茎之问夹角小于45。，这可能是由于CaRLK基因作为外源基因随机的整合到受体染色

8、体上，造成表型的变化。万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要提取T2代植株的DNA进行PCR反应。结果表明：T2代植株PCR扩增出与目的基因相同的大小529bp的条带，说明T2代植株已经稳定遗传了该基因；将T2代植株幼苗和普通幼苗移入不同浓度(50、100、150、200mmol／L)NaCl的MS培养基上培养，观察其生长及生根情况。结果表明：转基因植株在不同浓度下生长状况较对照要好，根系较对照也发达；野生型植株生长缓慢、根系生长发育迟缓。转基因植株在200mmol／LNaCl时为最适耐盐浓度。4、T3代种子的获得经T1代、T2代分子生物学鉴定及功能验