核磁共振电信号内标法在人体尿液定量分析中的应用.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第6期2010年6月ChineseJournalofAnalyticalChemistry789～794DOI．10．3724／SP．J．1096．2010．00789核磁共振电信号内标法在人体尿液定量分析中的应用杨亮茹阁英唐惠儒刘朝阳(波谱与原子分子物理国家重点实验室，武汉磁共振中心，中国科学院武汉物理与数学研究所，武汉430071)。(中国科学院研究生院，北京100039)摘要研究了Varian谱仪核磁共振电信号内标法在人体尿液代谢物浓度测定上的应用，通过实验证明了该方法进行定量分析的可靠

2、性。NMR电信号内标法原理上是通过Varian谱仪去耦通道在常规一维谱图上产生一个参考信号，并利用谱仪软件程序来调整该信号在频谱上的强度、频率、衰减速率等参数。避免了代谢组学中NMR定量实验需要添加已知浓度物质(例如TSP)作为内标而引起的内标物与样品相互作用、谱峰重叠、内标物不溶及弛豫时间太长等问题。研究结果表明，Varian谱仪去耦通道产生的电信号稳定可靠(标准偏差0．36％)，能够用于定量分析；当样品浓度大于20mmoL／L或小于2mmol／L时，该方法测定的相对误差分别为1％和5％。通过配制低浓度的尿液模型样品，验证了电信号内标法测量

3、人体尿液代谢物的浓度的可行性，最后使用该方法测量真实的人体尿液中常见代谢物的浓度，测定结果与医院常用生化分析仪器的测定结果相符关键词核磁共振；电信号内标；人体尿液；定量分析1引言核磁共振(NMR)定量分析作为一种分析复杂样品中化学成分含量的有效方法在有机化学，药物控制[3j，疾病诊断和代谢组学等研究领域有着广泛的应用。NMR定量分析的显著优点是经过一次实验就可以获得被测样品中所有成分的含量，因此，NMR定量分析方法对于尿液，血清等包含数以百计代谢物的复杂样品的浓度测量尤为重要13]。NMR定量实验通常需要一个参照标准，常见的参照标准是在样品溶

4、液中直接加入已知浓度的内标物，在NMR定量分析时，将样品指定基团上质子的共振峰面积与内标物共振峰面积进行比较，通过内标物作为参照计算样品的浓度。因此，所选的内标物必需溶于分析溶剂，与样品中任何组分不能有相互作用，并且内标物与样品共振峰不能重叠等。显然，这些对内标物的要求限制了NMR作为一个通用定量分析方法进行使用。Akoka等提出了NMR电信号内标法，通过测定样品中H／D的比例检测氘代试剂中氘百分含量，并把该方法应用到二维NMR和MRI的定量实验中7l18"。Ziarelli等¨一将电信号内标法应用于固体NMR实验中进行定量分析。这些NMR电

5、信号内标法定量实验基本上都是在Bruker谱仪上进行的。最近，Mehr等在Varian谱仪上使用一个定向耦合器把电信号耦合到NMR谱仪的接收通道实现了电信号内标法。本研究在Varian谱仪上采用了电信号内标法，即通过去耦通道产生一个电信号，并由探头”C线圈耦合到NMR谱仪的接收通道。通过实验证明了此方法定量分析的可靠性，并选择低浓度样品(如尿液)进行了分析应用，为代谢组学和生化检测等研究领域提供了一种通用可选的NMR定量分析的方法。2实验部分2．1仪器与试剂VarianINOVA500MHz高分辨核磁共振波谱仪(美国Varian公司)。甘氨酸

6、(Glycine)、二水合柠檬酸钠(Trisodiumcitratedihydrate)、葡萄糖(Glucose)、NaH2PO4·2H2O和K2HPO4·3H2O等(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；丙氨酸(Alanine)和缬氨酸(Valine，生化纯，上海贺宝化工有限公司)；DO20104~1．25收稿；2010-03—11接受本文系国家自然科学基金(Nos．10675162，20825520)，国家科技支撑计划(No．2006BAK03A22)，国家重点基础研究发展计划(No．2007CB914701)资助$E—mail：chyli

7、u@wipm．ae．cn790分析化学第38卷(99．9％)和TSP(3-Trimethylsilyl[2，2，3，3-D4]propionate)(美国CambridgeIsotopeLaboratory公司)。2．2样品制备称量10组甘氨酸(2．0～20．0mg)和TSP(1．8～6．0mg)，分别溶于10根含0．5mLD：0的5mm核磁共振样品管中(样品浓度见表1)，用于测量NMR电信号内标法定量分析的可靠性和误差范围。称量葡萄糖3．89mg，丙氨酸1．85mg，缬氨酸2．49mg，二水合柠檬酸钠5．93mg和TSP1．69mg，以D2

8、O配制的磷酸缓冲液(0．08mol／LKHPO4，0．02molfLNaH2PO4，pH=7．4)溶解，并定容至10mL(样品浓度见表2)。该低浓度模型样品，用来验