生物合成咖啡酸苯乙酯体系的液相色谱-串联质谱快速分析.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第11期2010年11月ChineseJournalofAnalyticalChemistryDOI：10．3724／SP．J．1096．2010．01657生物合成咖啡酸苯乙酯体系的液相色谱．串联质谱快速分析卢定强“’蒋奔王俊赵辉凌岫泉柴宏夏亭(南京工业大学药学院，南京210009)(江苏省药物研究所，南京210009)(江苏科技大学生物与环境工程学院，镇江212018)摘要建立液相色谱一串联质谱(LC—MS／MS)检测生物合成咖啡酸苯乙酯体系中咖啡酸(Caffeicacid，

2、CA)和咖啡酸苯乙酯(Caffeicacidphenethylester，CAPE)的方法。采用LC．MS／MS电喷雾电离(ESI)，负离子选择反应监测(SRM)模式检测。以(乙腈)：(水)：(冰醋酸)=55：45：0．5为流动相，流速1．0mIMmin，HypemilC色谱柱分离并检测生物合成咖啡酸苯乙酯体系中的咖啡酸以及咖啡酸苯乙酯的含量，并对生物合成咖啡酸苯乙酯的收率进行了动力学分析。本方法在进样量为0．2～20g时具有良好的线性关系，咖啡酸和咖啡酸苯乙酯样品的加标回收率分别为93．4％～98．2％和90．3％～97．8％

3、，相对标准偏差分别为1．79％～2．56％和1．82％～3．67％，咖啡酸苯乙酯收率在3d内可以达到15．54％，表明本方法简便、快速、可靠。关键词液相色谱一串联质谱法；咖啡酸苯乙酯；咖啡酸；生物(酶)合成体系1引言咖啡酸苯乙酯(Cafeicacidphenethylester，CAPE)，化学名为3一(3，4一二羟基苯基)．2-丙烯酸苯乙醇酯，是蜂胶中的主要有效成分，具有抗氧化⋯、抑制DNAJ、抗病毒、抗菌、消炎、抗动脉硬化及提高免疫力等多种药理活性，其中抗肿瘤活性最为显著，是当前新药研发的热点化合物。咖啡酸苯乙酯的制备方法大

4、致包括：植物提取法、化学合成法和生物合成法J。生物合成法耗时，但具有合成条件温和、操作简单、成本低等优点，72h内咖啡酸苯乙酯转化率可以达到15．54％，是广泛采用的制备方法。有关咖啡酸(Caffeicacid，CA)和咖啡酸苯乙酯测定已多有报道，包括不同样品来源，如蜂胶j、红景天(Rhodiolasacra)、苹果汁等，采用的测定方法主要有薄层色谱法、毛细管电泳法]、气相色谱法及高效液相色谱法等。但是，已报道的检测方法多适用于包含咖啡酸及其衍生物等多组分的天然产物的分离检测，操作繁杂，不适于咖啡酸苯乙酯生物转化体系中咖啡酸和咖

5、啡酸苯乙酯的分析。本研究对咖啡酸的生物转化进行了研究，建立了简单快速的测定生物合成咖啡酸苯乙酯体系中咖啡酸和咖啡酸苯乙酯的液相色谱一串联质谱方法。通过对咖啡酸苯乙酯生物合成体系中咖啡酸苯乙酯含量及其酶促反应动力学的测定和研究，以便于在化工设计和反应分离耦合的方向来提高生物法的工业化效率。2实验部分2．1仪器与试剂Waters2695型高效液相色谱仪、WatersMicromassQuattroMicroAPI型三重四级杆质谱仪，ESI源。MassLynx数据处理系统(美国Waters公司)；DHZ—CA恒温气浴摇床(太仓实验仪器

6、设备厂)；FA1104N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；MilliQ超纯水器(美国Millipore公司)。咖啡酸(南京泽朗医药科技有限公司)；咖啡酸、咖啡酸苯乙酯标准品、诺维信脂肪酶435(Sigma公司)；乙腈、甲醇、丙酮、冰醋酸(色谱纯，Sigma公司)；实验用水为经Milli．Q净化系统(0．22Ixm过滤膜)过滤的去离子水；氮气、氩气(>99．999％)；其它试剂均为分析纯。2．2色谱-质谱条件(1)液相色谱条件HypersilC8分析柱(250mm×4．6mnli．d．，5m，大连依利特公司)；流动2010-0

7、1-09收稿；2010~4—11接受本文系国家自然科学基金(No．20876076)，国家重点基础研究发展计划(No．2009CB724700)，江苏省自然科学基金(No．BK2009213)资助项目E—mail：ludingqiang@njut．edu．cn1658第38卷相：(乙腈)：(水)：V(冰醋酸)=55：45：0．5；流速：1．0mL／rain；进样量：20L；紫外检测器；检测波长：325nm；柱温：30℃。(2)质谱条件电喷雾离子源(ESI)，负离子模式，选择反应检测(SRM)，喷雾电压：2800V，离子传输毛细管

8、温度：350℃，源内碰撞诱导解离电压：20V，锥孑L气流速：1．2l_／min，干燥气(N)流速：10L／rain，碰撞气体为氩气。2．3对照品溶液的配制准确称取咖啡酸苯乙酯和咖啡酸对照品各10mg于10mL容量瓶，用流动相溶液超声溶解并定容，作为母液。再将该母