扫描电镜及其制样技术.ppt

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1、扫描电镜技术TechniquesofScanningElectronMicroscope一、扫描电镜的基本结构与成像原理二、扫描电镜的特点三、扫描电镜的生物样品制备技术（一）样品的常规制备方法（二）特殊样品的制备方法扫描电镜技术扫描电镜（ScanningElectronMicroscope，SEM）是继光镜和透射电镜之后发展起来的一种电镜，用于观察物质表面及断面的三维形貌结构和进行微区成分分析。一、扫描电镜的基本结构与成像原理1、SEM基本结构及其作用（１）电子光学系统电子枪：阴极、阳极、栅极。阴极—通电加热后产生电子

2、束。阳极—加速电子束。栅极—控制和会聚电子束流。电磁透镜：会聚电子束，形成直径5~10纳米的电子束（即电子探针），照射于样品上。图1-1扫描电镜工作原理图（２）检测系统①二次电子的来源及作用在样品表面以下几纳米到几十纳米的区域，被入射电子（初级电子、一次电子）所激发出来的样品原子中的外层电子，称谓二次电子（次级电子）。SEM通常是由二次电子所形成的图象来显示生物样品的表面形貌。（２）检测系统②二次电子检测系统的组成及作用组成：检测器（二次电子探头）、光电倍增管、视频放大器。作用：对二次电子进行收集、放大和处理，以调制显像

3、管栅极电压并成象。图1-1扫描电镜工作原理图（３）电子偏转系统（扫描系统）组成：扫描发生器、扫描线圈。作用：使镜筒和显像管内的电子束分别进行同步光栅状扫描，最后在显像管的荧光屏上显示出完整图象。图1-1扫描电镜工作原理图2、影响图象形成的因素（1）倾斜角效应——二次电子成像原理∵二次电子产率主要取决于电子束的入射角，而入射角又主要取决于样品的倾斜程度。∴样品的倾斜角效应是影响图象反差的主要因素。∴SEM图象的反差主要是由样品表面的凹凸状态决定的，越是凸出的部位产生二次电子的数量越多，图象越明亮，反之则较暗。图1-2样品倾

4、斜对二次电子产率的影响2、影响图象形成的因素（2）原子序数效应原子序数效应：样品内原子序数不同的元素，在图象上也会形成一定的亮度差异，这种现象称为原子序数效应。对策：观察生物样品时，在样品表面喷镀一层原子序数高的金属膜，可提高图象质量。2、影响图象形成的因素（3）充放电效应充电：当初级电子轰击干燥的生物样品表面时，会因其导电性能差而发生电荷积累的充电现象，并对随后到来的初级电子产生排斥，使电子散开，且导致二次电子发射轨迹偏斜或杂乱。放电：轰击区内电子堆积，与邻近区域间产生电位差，则可产生放电打火现象。充放电效应：上述充、

5、放电状况造成图象忽明忽暗或模糊不清等现象，称为充放电效应。对策：采用金属镀膜、导电胶粘贴样品等导电处理，可减少充放电效应的影响。图1-4血细胞充放电效应图例二、扫描电镜的特点（一）图谱（二）扫描电镜的特点观察表面形貌。图象景深大，富有立体感。放大范围广，分辨率较高：放大倍数为数10倍~数10万倍；分辨率取决于电子探针的直径，一般为5~10nm。可观察块状样品：0.5~10cm3。样品制备简单。可结合元素分析。三、扫描电镜生物样品制备技术（一）样品的常规制备方法取材→清洗→固定→清洗→脱水→干燥→金属镀膜→SEM观察1、取

6、样取样部位要准确。取样大小要适当：常为≤1cm3。取样操作要轻巧快捷：取样要快，严防对样品的挤压损伤，以使样品更近于活体状态。样品的基底部应切割平整（以便于样品粘贴），观察面应作好识别标记。2、清洗（1）清洗的目的：充分暴露样品观察面的表面特征。（2）清洗液的选择常规洗液——生理盐水、PBS等缓冲液；特殊洗液——低浓度的蛋白水解酶或乙醇等，用于表面覆盖着大量蛋白或脂类黏液的样品（如胃、肠黏膜及乳腺组织等）的初级清洗。（3）清洗的方法浸泡清洗。震荡清洗：一些粘着杂质多而紧密的样品（如胃、肠黏膜等），可利用震荡器进行震荡清洗

7、。离心清洗：游离细胞、微生物及其它微小生物样品的清洗。（4）清洗的要求样品要清洗干净：换液数次，可在解剖镜下检查，直至干净，以充分暴露表面特征。3、固定（1）固定的目的保留样品的微细结构和外部形貌，使其更近于生活状态。使组织硬化，以增强样品在随后的干燥过程中耐受表面张力变化的能力。提高样品对镜筒内高真空和电子束轰击的耐受力。（2）常用的固定剂戊二醛：常用浓度为1~4%。锇酸：一般用1~2%浓度。（3）固定的方法先用戊二醛固定1至几小时或更长，经缓冲液充分清洗后，再用锇酸固定30~60分钟。4、脱水（1）脱水的目的用低表面

8、张力且易挥发的有机溶剂（乙醇、丙酮等）取代组织细胞中的游离水，使样品在后续干燥处理时的表面张力减少。表1几种液体的表面张力单位：达因/cm液体乙醇丙酮水表面张力16.49（20℃）21.16（40℃）70.61(20℃）（2）脱水的方法PBS清洗3次，5~10min/次→乙醇梯度脱水到纯乙醇，5~30min/级。（3