周围环境中微生物的观察及从土壤中分离纯化微生物.doc

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1、周围环境中微生物的观察及从土壤中分离纯化微生物1.实验H的和要求（1）通过对周围环境屮微生物的观察，理解无菌操作原理，了解微生物的普遍存在性。（2）通过从土壤屮分离纯化微生物，掌握无菌操作技术。2.实验材料和仪器2.1配制肉汤蛋口腺固体培养基平板（每组15个）(1)牛肉膏5g；⑵蛋白豚10g；(3)Nad5g；(4)琼脂20g；(5)自来水lOOOmLpH7.5,0.IMPa,121°C来菌20min。2.2无菌牛理盐水（1）250mL三角瓶中加入99mL0.9%NaCl（加20个左右的玻璃珠）；（2）250mL三角瓶中加入5

2、0mL0.9%NaCl（作10倍稀释用）。2.3仪器及器皿（1）带螺帽试管5支；（2）牙签2支；（3）5mL及lmL吸头2支；（4）涂布棒2支；（5）5mL及ImL取液器各一支;（6）30°C和37°C培养箱;（7）接种环、酒精灯和火柴；（8）摇床。（1）-（4）要求事先灭菌。2.实验方法和步骤3.1从土壤中分离和纯化微生物(1)采土样选择较肥沃的土壤，铲去表土层，挖5-20cm深度的或特殊要求的地方土壤数10g,装入灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，做好编号记录，携回实验室供分离用。(2)制备土壤稀释液称取土样1.Og放入盛99

3、mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶小，置摇床振荡5n)in使土样均匀分散在稀释液屮成为土壤悬液(10-2)。用lmL的无菌吸头从屮吸取0.5niL土壤悬液注入盛有4.5niL无菌水的试管屮，吹吸3次，振荡混匀(10-3)o然后再用同一-支ImL吸头，从此管屮吸取0.5mL注入另一盛有4.5mL无菌水的试管中(10-4),依此类推制成10-5,10-6,10-7各种稀释度的土壤溶液。2.2涂布用一支ImL无菌吸头分别从稀释度10-7.10-6和10-5的土壤稀释液屮各吸取0.lmL对号放入己写好稀释度的肉汤蛋白腺培养基平板上，用无菌

4、玻璃涂棒在培养基表而轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做3个平板。1.3培养将平板倒置于37°C温箱屮培养48h。统计每个平板长出的平均菌落数。根据下而菌落计数方法，算出每克土壤中的细菌含量。3.4菌落计数方法先计算相同稀释度的平均菌落数。若其小一个培养皿有较大片菌苔生长吋，则不应使用，而应以无片状菌苔生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，可将此一半的菌落数乘2以代表全部平皿的菌落数，

5、然后再计算该稀释度的平均菌落数。首先选择平均菌落数为30〜300的平板，半只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围吋，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数即为该样詁屮的微生物总数。若有两个稀释度的平均菌落数为30〜300,则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2,应采取两者的平均数：若大于2,则取其屮较少的菌落总数。若所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。若所有稀释度的平均菌落数均不在30〜300Z间，则以最接近30

6、或300的平均菌落数乘以稀释倍数。例子不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数/个/niL10=10三10心113651642016400或1.6X10422760295461.637750或3.8X10432890271602.227100或2.7X1044无法计数1650513513000或5.IX105527115270或2.7X1026无法计数3051230500或3.IX104注：两位以后的数字四舍五入的方法去掉。