《抗原抗体反应》PPT课件.ppt

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1、1ppt课件制作及讲课原则自愿有兴趣组织方式分组讲选出最好在班上讲内容自选数量15张分别折算123次作业2上章小结：一﹑基本概念主要组织相容性复合物等二﹑MHC抗原的结构和功能MHC-IMHC-II结构、功能及两者与肽结合的区别三﹑MHC抗原基因多态性及结构四﹑MHC的检测原理和应用3第七章抗原抗体反应及应用一节﹑抗体的制备二节﹑抗原抗体反应三节﹑抗原抗体反应的应用4一节﹑抗体的制备一﹑抗血清的制备及抗体纯化二﹑单克隆抗体的制备三﹑抗体工程四﹑催化性抗体五﹑抗体在抗肿瘤治疗中的应用继续5一﹑抗血清

2、的制备及抗体纯化1、抗血清的制备抗血清：含有能与相应抗原结合的抗体分子的免疫动物血清。③抗血清的纯化见下图①免疫动物抗原(半抗原需经转化)佐剂乳化免疫动物②抗血清的制备抗血清的效价测定采血获得抗血清6抗血清+3倍体积0℃ddH2O,调pH到7.7加50%-20℃酒精至最后质量分数为20%(保持-5℃)上清沉淀(含IgG/IgA/IgM/杂蛋白)悬浮于0.015-0.02mol/L冷NaCl,用0.05mol/L醋酸调pH至5(<0℃)上清液沉淀(含IgA/IgM/杂蛋白)用0.5mol/LNaH2

3、PO4调至pH7.4,-20至-30℃95%酒精至最后质量分数为25%，维持在-6℃上清沉淀(IgG)悬浮于ddH2O,用0.05mol/L醋酸调至pH5.1上清液沉淀调pH至5.5,离子强度为0.01—0.0075,加50%冷酒精至最后质量分数为10%(-3℃)沉淀(IgA/IgM)上清通过分子筛将二者分开2、抗体初步纯化7抗血清的初步纯化只是多数抗体类别的纯化。上述冷酒精沉淀法是1946年Cohn创立的较好方法。该法得到的只是较粗Ig。硫酸铵盐析法：比较简便，蛋白质变性小，33%饱和硫盐沉淀各

4、类Ig，分离纯度较差。浓盐使IgA形成二聚体，不宜采用。离子交换层析法：通过层析法，才能获得高纯度某一类Ig。83、抗体进一步纯化IgG在血清中含量最高，占75—80%，纯化的方法常用33-50%硫铵盐析和DEAE-纤维素柱层析法。IgG在pH7.5溶液中带正电荷，其它血清蛋白都带负电荷，因此可用阴离子交换剂DEAE-纤维素一次将IgG提纯到很高的纯度。分离纯化IgM常用18%硫铵沉淀，再DEAE-纤维素柱层析，收集洗脱液，再用分子筛分离，获纯化的IgM。获得的纯化Ig，在4℃保存，长期保存需在-

5、20℃以下。9问题：血清中的抗体是由多个抗原决定簇刺激B细胞克隆而产生的抗体，是多克隆抗体(PAb)，通过分离的方法不可能获得真正的单一抗体。如何获得大量的一种抗体？由单一B细胞克隆而产生的抗体，称单克隆抗体(MAb)。二﹑单克隆抗体的制备101、制备MAb(monoclonalAb,mAb)的原理利用B细胞能分泌抗体而肿瘤细胞能在体外长期培养并可低温保存的优点，通过细胞杂交，融合二类细胞，从而筛选得到既有抗体分泌性又有不断分裂性的杂交瘤细胞，将其细胞单克隆化。用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体

6、的生产，称为杂交瘤技术。该技术是1975年由G.Köhler&Milstein创立的。112、制备MAb的基本过程免疫小鼠品种、加强3d脾脏单细胞悬浮洗掉血清骨髓瘤细胞营养缺陷型PEGHAT培养基37℃5%CO2选抗体分泌株克隆阳性细胞,1细胞/孔增殖阳性克隆-70℃或液氮冻存细胞腹水制备扩大培养中空纤维反应器继续12返ProceduresforProducingHybridomasandMonoclonalAntibodies13用于制备B细胞的小鼠常用Balb/c品系，为H-2d单元(倍)型。

7、B细胞从小鼠的脾脏制取。为保证B细胞有旺盛的分泌抗体活性，分离前3天一次静脉加强免疫。B细胞要悬浮于没有血清的培养液。⃆骨髓瘤细胞有多种细胞株，营养缺陷型是一种。缺陷是细胞缺少次黄嘌呤、鸟嘌呤核苷酸转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)，另一条核酸合成必须酶。当合成核酸的正常途径被阻断后（培养基中加入氨基喋呤），虽然培养基中有这二种底物(次黄嘌呤、胸腺嘧啶)，但缺陷细胞仍不能合成核酸而死亡。如果骨髓瘤细胞与B细胞发生了融合，因B细胞有正常的2套核酸合成酶系，正常途径受阻后，能利用培养基中的次黄

8、嘌呤(H)、胸腺嘧啶(T)来合成核酸，因此融合后的杂交瘤细胞能在选择培养基中正常分裂生长。骨髓瘤细胞还应该具有不能合成抗体或合成了也不能分泌的特性融合时，骨髓瘤细胞应处于对数生长期，B细胞有旺盛的分泌抗体活性。融合细胞按B细胞：骨髓瘤细胞＝5—10：1，总细胞数在107--108水平。加入融合剂：50%的聚乙二醇(PEG)，37℃下融合1—2min。然后用培养液RMPI1640进行洗涤稀释，去除PEG后，于HAT培养基上培养.14筛选抗体分泌株：是将对HAT上形成的杂交瘤细胞集落进