课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段.pptx

《课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段.pptx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、专题5DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？ＰＣＲ技术一、DNA分子的双螺旋结构①DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋成的双螺旋结构.②脱氧核糖与磷酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧.③两条链上的碱基通过氢键连接成碱基对。规律：即腺嘌呤一定

2、与胸腺嘧啶配对,鸟嘌呤一定与胞嘧啶配对.5’端3’端二、DNA的复制2、时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期3、场所细胞核（主）、线粒体、叶绿体1、概念以亲代DNA为模板合成子代DNA的过程4、基本条件酶、ATP、原料、模板5、复制过程①DNA的解旋亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链。②RNA引物的合成以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物。③DNA的生成以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。④切掉引物生成冈

3、崎片断在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为冈崎片断。⑤DNA片断的连接在DNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的DNA链。新链与旧链构成新的DNA。ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶DNA解旋解链合成引物子链延长5、复制过程ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链

4、延长GGAUCG5’AUCGCG5’引物酶引物酶ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5’AUCGCG5’TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶边解旋边复制(过程）6、复制特点半保留复制（结果）7、精确复制的原因8、复制的意义DNA分子通过复制，将遗传信息从亲代传给了子代，从而保持了遗传信息的连续性。①独特的双螺旋结构为复制提供了精确

5、的模板②碱基互补配对保证了复制准确地进行PCR(聚合酶链式反应）1、DNA聚合酶特性不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。2、DNA聚合酶作用过程当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。3、PCR原理①在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。③PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来

6、控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。4、TaqDNA聚合酶的应用5、缓冲液需要为PCR反应提供的物质DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。①PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸6、细胞内复制和PCR不同点

7、②PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的PCR的反应过程1、PCR的反应步骤PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸.①变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至940C。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。2、循环过程②复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。③延伸DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原

8、料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件