课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段.pptx

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1、K.B.Mullis1993年获诺贝尔生生理学奖课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段基础知识（一）DNA分子的结构1、DNA分子的基本组成单位:2、脱氧核苷酸的结构模式:脱氧核糖核苷酸，简称脱氧核苷酸。基础知识（一）DNA分子的结构3、脱氧核苷酸链的结构模式:脱氧核苷酸链的羟基(-OH)末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。GATGCACT氢键5'端3'端5'端3'端基础知识基础知识（一）DNA分子的结构4、DNA的平面结构模式:基础知识（二）PCR原理请阅读《教材》P58内容并结合视频分析：1、DNA复制需要哪些基本条件？它

2、们分别起什么作用？解旋酶：打开DNA双链；DNA母链：提供DNA复制的模板；4种脱氧核苷酸：合成子链的原料；DNA聚合酶：催化合成DNA子链；引物：使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。基础知识（二）PCR原理请阅读《教材》P58内容，分析：3、DNA聚合酶的作用有何特性？DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。2、什么是引物？若要在体外克隆DNA，需要加入几种特定的引物？【提示】引物是指能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的一小段DNA或RNA片段。克隆DNA时应加

3、入两种引物。基础知识（二）PCR原理请阅读《教材》P58内容，分析：4、为什么DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸？DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3’端开始延伸DNA链。基础知识（二）PCR原理请阅读《教材》P59内容，分析：5、在生物体外如何将DNA的双螺旋打开？DNA的热变性原理：在80-1000C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程就称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合

4、成双链，这称为复性。PCR就是利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。根据DNA的热变性原理，通过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的。水浴锅PCR扩增仪基础知识（二）PCR原理请阅读《教材》P59内容，分析：6、高温能将DNA的双螺旋打开，但同时也可能使DNA聚合酶失活，怎么办？耐高温的TaqDNA聚合酶的发现和应用解决了以上矛盾。基础知识（二）PCR原理小结：PCR反应需要在一定的中才能进行，并需要提供：同时通过使DNA复制在体外反复进行。缓冲溶液（类似细胞核液）DNA模板两种引物四种脱氧核苷酸耐热的D

5、NA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）控制温度基础知识PCR一般要经历30多次循环，每次循环可以分为三步：变性、复性和延伸。在循环之前常要进行一次预变性（目的是增加模板DNA彻底变性的概率）。（三）PCR的反应过程重复1～3步30轮基础知识（三）PCR的反应过程1．变性：当温度上升到____0C以上时，双链DNA解聚为单链。90靶序列靶序列基础知识（三）PCR的反应过程2．复性：温度下降到____0C左右，两种引物通过_____________与两条单链DNA结合。50碱基互补配对靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3

6、’基础知识（三）PCR的反应过程3．延伸：温度上升到___0C左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在___________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。72DNA聚合酶靶序列靶序列基础知识从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应.DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。（三）PCR的反应过程想一想？在构建基因表达载体的时候，通过限制性内切酶和DNA连接酶把目的基因和载体连在一起。若目的基因序列不含载体的限制酶酶切位点，请问如何利用PCR技术在目的基因的两端

7、加入限制酶酶切位点？体内DNA复制与PCR的技术区别：体内复制PCR技术解旋引物一般用DNA片段DNA聚合酶TaqDNA聚合酶复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。复制的方向子链的5’端向3’端延伸在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶一小段RNA细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温）半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。子链的5’端向3’端延伸查一查？在进行体外扩增DNA时，为什么用高温变性，而不用解旋酶？