scs共培养对humscs向胰岛前体细胞诱导分化的影响.docx

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1、养层，与hUMSCs共培养，比较在不同诱导条件下hUMSCs向胰岛前体细胞诱导分化中Ngn3、Pdxl表达的差异性，观察对hUMSCs向胰岛前体细胞诱导分化的影响，进一步探讨在诱导分化过程中的作用机制，为进一步的动物实验和临床研究提供理论依据和技术支持。材料与方法1•材料1.1实验标本脐带來源剖宫产手术的健康足月产儿由贵阳医学院附属医院产科提供，家属知情同意。孕妇经检测无传染病原体如艾滋病、乙型肝炎和丙型肝炎病毒及梅毒螺旋体、支原体。小鼠屈昆明种雄性鼠，生长时间15天内，来源于贵阳医学院实验室动物中心。1.2主要试剂DMEM/F12普通培养基、胎牛血清、青霉素■链霉素、0.

2、25%胰蛋白酶(Hyclone,美国)鼠抗人CD105单克隆抗体、鼠抗人insulin单克隆抗体、FITC标记山羊抗兔IgG、SABC-FITC(DOD)免疫组化双显色试剂盒(北京中衫公司)兔抗人CD34、CD45、CD90单克隆抗体(博士德公司北京)；鼠抗人Ncstin单克隆抗体(博士德公司，北京)兔抗鼠Fas-L单克隆抗体(SantaCruzBiotechnology)兔抗人Pdxl单克隆抗体(EPITOMICS)鼠抗人Ngn3(Genetx)ETK-CPE-1试剂盒(Ray-Bio)激活素A(PEPROTECH)内皮生长因子EGF(PEPROTECH)尼克酰胺(罗氏)

3、3-actin抗体(Abmart)IgG-IIRP(Abmart)SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、SDS-PAGE蛋口上样体系、BCA蛋白浓度测定试剂盒、一抗稀释液、二抗稀释液（碧云天）预染蛋白（feimentas）化学发光底物（Millipore）显影液、定影液（柯达）1.3器材Transwell-insert小室（Millipore公司,美国）X射线胶片（柯达）倒置相差显微镜（C-SHG,Kikon,Japan）台式低速离心机（80-2,上海）高速低温离心机（CT15RE,HITACHI,Japan）水套式CO2细胞培养箱（NU・4750E,NUAURE,USA）超纯水

4、制备系统（CLDJ261301,Pall,USA）Rcvco低温冰箱（VLT1386・3・V/Thcrmofisherscientific,Inc.USA）200冃细胞筛（上海新睿公司）鼓风干燥箱（GIX・9000,上海博讯）全自动压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50A上海博讯）-20度冰箱（BCD・249CF,合肥美菱）稳流电泳仪及电泳槽（DYY・III・5,六一仪器厂，北京）酶标仪（BioTek,美国）2.实验方法hUMSCs分离、培养与鉴定hUMSCs分离与培养采集健康足月剖宫产儿脐带长度8-10cm,直径l-2cm,4°C保存，6小时内使用。在超净工作台内使用灭菌过的

5、PBS尽量洗净血管内残留的脐血，将脐带每2-3cm剪成一段，纵向剪开脐静脉后剥除静脉内皮，剥离脐动脉。PBS清洗数遍,至无脐血残留。将脐带剪成2mm3大小，加入1ml含有15%FBS的lmlDMEM/F12培养基，浸泡2・3分钟，使用眼科银夹取组织块植入T25培养瓶内，3・4个组织块聚在一起呈阵列式分布，每组织块之间相隔5mm.瓶底朝上倒置在37°C、5%CO2培养箱内2小时后，取出再加入4ml的15%FBS的DMEM/F12培养基继续培养。第5天换液，加入4mlDMEM/F12培养基（12.5%FBS）,若有组织块漂移将其取出。待原代细胞铺满瓶底面积的70%时，倒掉瓶内培

6、养基和剩余组织块，PBS洗3次，0.25%胰酶消化1分钟，小心吹打瓶底收集细胞，1000转/分、离心5分钟，以2：1传代，每瓶内加入4mlDMEM/F12培养基（12.5%FBS）,以后每2・3天换液。观察细胞铺满瓶底面积的85%-90%时，0.25%胰酶消化，传代（1：2）,接种培养瓶内继续培养，每瓶加入4ml含有12.5%FBS的DMEM/F12培养基。传至第3代细胞用于实验。hUMSCs的鉴定免疫细胞化学技术鉴定其膜表面标记分子兔抗人CD90、鼠抗人CD105、兔抗人CD34、兔抗人CD45o具体操作步骤如下：将第3代细胞以1x10’密度接种在细胞爬片上，第2天观察细

7、胞若已经贴壁细胞形态好，吸取培养基，PBS洗涤2次，每次2分钟；4%多聚甲醛固定细胞30分钟后，PBS洗涤3次，每次2分钟；0.2%TritonX—100作用10分钟后（在细胞膜上打孔），PBS洗涤3次，每次2分钟；3%的过氧化氮室温作用20分钟（灭活细胞内源性酶），PBS洗涤3次，每次2分钟；用山羊血清（1：100）封闭，20分钟后吸去多余的山羊血清；加入一抗（1：100）,4°C孵育过夜，次日取出PBS洗3次，每次5分钟.加入IgG抗体（1：100）置于37°C烤箱20分钟，PBS洗4次，每次5分钟.加入1%。