包涵体纯化方案.doc

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1、包涵体纯化方案缓冲液配方：1.变性复性缓冲液缓冲液A：50mMTris-HCl(pH8.5),1mMEDTA①,100mMNaCl②,1%TritonX-100③缓冲液B：50mMTris-HCl(pH8.5),1mMEDTA,100mMNaCl，1%TritonX-100，2M脲素④缓冲液C：50mMTris-HCl(pH8.5),1mMEDTA,100mMNaCl，1%TritonX-100缓冲液D：50mMTris-HCl(pH8.5),1mMEDTA,100mMNaCl，1%TritonX-100，2M盐酸胍④溶解缓冲液E：50mMTri

2、s-HCl(pH8.5),1mMEDTA,100mMNaCl，10mMβ-巯基乙醇/DTT⑤，2mM脱氧胆酸钠⑥，8M脲素复性缓冲液：50mMTris-HCl(pH8.5)，100mMNaCl，6M/4M/2M脲素,1%甘氨酸⑦，5%甘油⑧，0.2%PEG⑨，1mM氧化型谷胱甘肽，1mM还原型谷胱甘肽⑩2.纯化缓冲液Bindingbuffer：50mMTris-HCl,100mMNaCl,10mM咪唑，pH8.5Elutionbuffer：50mMTris-HCl,100mMNaCl,不同浓度梯度咪唑,pH8.5具体实施步骤：1.大量诱导表达的菌

3、液7000rpm离心10min。弃上清，用1×PBS重悬，洗涤菌体细胞，7000rpm，离心10min。再用PBS重复洗一遍。离心后留菌体沉淀。2.将菌体细胞用缓冲液A重悬，液氮中反复冻融后，超声破碎。13000rpm离心10min，弃上清，收集包涵体沉淀。2.分别用缓冲液B、C、D超声清洗包涵体沉淀。13000rpm离心10min收集沉淀。3.用缓冲液E溶解包涵体，缓慢摇动使其缓慢溶解，室温放置30min，然后13000rpm离心10min。取上清。4.将上清稀释至0.1-1.0mg/ml，装入透析袋中，放置于梯度复性缓冲液中，4℃缓慢透析24

4、-36h。最后在纯化bindingbuffer中透析，确保蛋白稳定可溶。5.对溶解的包涵体蛋白进行亲和层析。附注：①EDTA防止蛋白降解②NaCl一定的盐离子可降低某些带电基团间的斥力③TritonX-100除去其他细菌成分，如膜外蛋白，质粒DNA和其他杂质④脲素，盐酸胍，洗掉包涵体表面的不溶性杂蛋白⑤β-巯基乙醇/DTT作为还原剂打开错配的二硫键⑥脱氧胆酸钠作为离子型去垢剂能促溶蛋白⑦⑧甘氨酸、甘油促溶⑨PEG可逆修饰折叠中间体的疏水基团⑩氧化型和还原型谷胱甘肽促进二硫键的形成。(11)1g菌使用35ml液体重悬即可。