分光光度法快速检测细菌.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第4期2010年4月ChineseJournalofAnalyticalChemistry573～576DOI：10．3724／SP．J．1096．2010．00573分光光度法快速检测细菌李冬阳茹柿平吴坚应义斌(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州310029)摘要采用分光光度法来检测完整细胞内H0酶的活性，以实现细菌的快速检测。由于细菌(本研究以E．coliDH5a为模型)内含有HO酶，当往菌液中加入H：O：时，HO会在胞内HO：酶的作用下分解，其分解过程遵循一级动力学反应。通过测量该反应中HO在24

2、0nm处吸光度的变化，可以得出该一级反应的速率常数，从而获悉菌液的浓度。结果表明：大肠杆菌单位细胞浓度酶活为4．2×10L／(s·cel1)，其速率常数与浓度在5．7×10。～5．7×10cfu／mL范围内呈现良好的线性关系，检出限为5．7X10。cfu／mL。本方法是一种检测细菌总数的快速方法，测试时间为5～10min。关键词细菌检测；过氧化氢酶；酶活性；分光光度法；生物传感器1引言摄人含有细菌或细菌毒素的食品会引起细菌性食物中毒。美国疾控中心(CDC)估计，美国每年食源性致病菌的病例约7600万，其中5200例死亡¨。1999～2000年，在我国东部部分

3、地区发生了较大规模的E．coli0157：H7爆发，对我国经济造成了重大损失J。解决由细菌性中毒引发的食品安全问题尤为紧迫。然而，由于目前检测手段普遍存在耗时长、操作复杂和成本高等问题，严重制约了食品安全监控技术和管理体系的完善及实际运行。因此，建立和推广准确、快速和低成本的细菌检测技术很有必要。目前，快速检测细菌的技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附(ELISA)和生物传感器等。PCR技术灵敏度高，相对耗时短，但对操作人员的技术要求较高。ELISA技术较为成熟，但成本较高，用于显色的苯类有机试剂易对人和环境造成不利影响。生物传感器作为一种新兴

4、技术，以其检测快速而闻名，但由于其构成涉及敏感的生物材料，稳定性和重复性问题，严重影响着这项技术投入量产。近年来，通过检测样品中与细胞浓度成正比的细胞内含物(如ATP和酶)来快速监测细菌已引起了广泛关注。酶中以监测HO酶(Catalase)的活性来检测细菌的研究最多。由于HO酶会催化分解HO而产生氧气和水，检测HO酶的活性需监测反应中产物(O)的增加或反应物(HO)的减少。目前，通过监测HO，来测过氧化酶活性的方法主要有滴定法J、形成中间产物比色法、化学发光法、荧光法nj、电化学法J2j和分光光度法¨引。其中电化学法和分光光度法最为简便，它们不仅可以实现实时

5、监测，也无需引入额外的试剂。电化学法因电极易受样品污染等因素导致其稳定性和重复性较差；分光光度法灵敏度相对要低，但稳定性好。分光光度法的应用多限于对纯酶的研究，且通过间隔(Stop—watch)手动测吸光值来研究动力学过程，尚未见将该法用于完整细胞HO酶活测试的报道。本研究采用分光光度计法的动力学实时测量模式来监测与完整细胞作用时HO的变化，并以此测定酶活性，建立了定量测试细菌浓度的方法。2实验部分2．1仪器与试剂2550紫外分光光度计(日本岛津公司)；Ⅱ级生物安全柜(新加坡ESCO公司)；高速冷冻离心机(德国SOVALL公司)；SPX一250智能生化培养箱

6、(赛福公司)；全自动灭菌锅(台湾浩翰公司)；SK3300HP超声清洗器(科导公司)；BS224型电子天平(德国Sartorius公司)；数据分析采用Origin软件。2009-08—10收稿；2009—12-02接受本文受教育部新世纪人才项H(No．NCET-07-0725)、浙江省重点科技项目(No．2008C14077)和国家科技专项(No．2009ZX08012-004B)资助$E—mail：wujian69@zju．edu．cn574分析化学第38卷LB培养基，10mmol／LPBS缓冲液(pH7．4)，30％H2O2溶液(国药集团)，所用试剂均为分

7、析级以上；实验用水通过去离子水机(法国Millipore公司)制各。2．2实验方法2．2．1大肠杆菌的培养与计数大肠杆菌E．coliDH5c~由浙江大学食品系提供。用LB培养基在37qc条件下培养24h，在4cc、8000g条件下离心15min，取出上清液，将菌泥再用PBS悬浮，之后再离心(5min)和悬浮两次以确保得到将培养基冲洗干净的细菌悬浮液。取0．1mL所得菌液进行梯度稀释，采用传统的平板计数法计数。将其余的菌液稀释得到不同浓度待测菌液样品。为方便表示，将离心后所得到的E．coli菌原液浓度定义为E[0]，意为0倍稀释；其逐步倍比稀释得到0．5E[0

8、]，0．25E[0]，0．125E[0]；将菌原液进