双水相萃取结合液相色谱法分离蛋白质.pdf

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1、第4O卷分析化学(FENXIHUAXUE)特约来稿第1期2012年1月ChineseJournalofAnalyticalChemistry38～42双水相萃取结合液相色谱法分离蛋白质赵新颖lJ屈锋董敏陈凡罗爱芹张经华(北京理工大学生命学院，北京100081)(北京市理化分析测试中心，北京100089)摘要建立了PEG／(NH)SO双水相体系萃取富集，结合液相色谱分离分析多种蛋白质的方法。考察了无机盐种类和浓度、PEG分子量、pH值和温度等因素对双水相形成以及对细胞色素C、肌红蛋白、牛血清白蛋白、溶

2、菌酶、胰蛋白酶分配行为的影响。结果表明，上述5种蛋白在室温、pH3．5～9．0范围内，可在15％PEG-4000／10％(NH)SO双水相体系中得到富集，且主要集中在下相。同样条件下，血清中的高丰度蛋白在上下相均有分配，下相分配量较大。通过双水相萃取分离蛋白质及对液相色谱一定时间段的色谱峰收集，可初步实现血清中高丰度蛋白质的分离去除。关键词双水相萃取；蛋白质分离；血清1引言复杂生物体系中蛋白质组分的高效分离是生物、医药、化工等领域研究和生产的基础。盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法等传统分析方法普

3、遍存在萃取效率较低、操作步骤繁琐、分离过程中容易发生蛋白质变性等不足。双水相萃取具有操作简单、成本低廉、易于放大、条件温和、保持蛋白质活性等优势，在生物大分子分离中得到广泛关注_l~，在蛋白质组学研究中也有应用。目前，双水相萃取主要用于单一组分蛋白质的分离富集，由于选择性分离和检测方法的限制，多组分蛋白质的相关报道较少。本研究在前期工作基础上，进一步考察了影响PEG／无机盐双水相体系形成的因素，并结合液相色谱法研究了细胞色素c、肌红蛋白、牛血清白蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶和血清样品在双水相体系中的分配行

4、为，初步实现了多种蛋白质的分离分级。本方法可用于血清样品的萃取分离，是一种简便、低成本的样品预处理方法。2实验部分2．1实验试剂细胞色素C、肌红蛋白、溶菌酶、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、人血清白蛋白、聚乙二醇系列(PEG一2000至PEG一20000，分析纯，北京拜尔迪生物技术有限公司)；乙腈(色谱纯，北京迈瑞达科技有限公司)；三氟乙酸(TFA，分析纯，北京蓝弋化工产品有限责任公司)；NaHPO，NailPO，(NH)：SO，H。PO，H：SO，NaOH，NaC1等均为分析纯试剂；人血清来源于北京血液中

5、心；实验用水为去离子水。2．2色谱条件LC一20A高效液相色谱仪配有二极管阵列检测器(日本Shimazu公司)；Zorbax300SB—C反相色谱柱(250mm×4．6mm，5mm，300A，美国Agilent公司)。流动相A：乙腈一0．1％TFA，B：水一0．1％TFA。梯度洗脱：0～30min，30％～60％A。检测波长214nm，进样量10uL。2．3溶液的配制及萃取2．3．1储备液配制配制质量比为40％(NH)：SO溶液及5g／L细胞色素c、溶菌酶、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、肌红蛋白溶液，4℃

6、保存。2．3．2双水相蛋白质溶液配制依次加入0．375gPEG，0．625g40％(NH)SO，分别加入100gL细胞色素C、溶菌酶、肌红蛋白、牛血清白蛋白溶液，5300gL胰蛋白酶溶液，以去离子水定量至2．500g。201卜06-23收稿；201卜07-29接受本文系国家重点基础研究发展计划(No．2007CB914101)和国家自然科学基金(No．20875009)资助项目E-mail：qufengqu@bit．edu．cn第1期赵新颖等：双水相萃取结合液相色谱法分离蛋白质392．3．3双水相血

7、清样品配制依次加入0．150gPEG，0．250g40％(NH4)2SO4，200L血清，以去离子水定量至1．000g。2．3．4血清对照样品配制200¨L血清，以去离子水定量至1．000g。将上述双水相溶液分别在4000r／min下离心10min，静置分相后标记分相界面。分别取上下两相进行液相色谱检测，根据蛋白质峰面积和相比计算蛋白质质量。3结果与讨论形成稳定的高聚物／无机盐双水相是蛋白质萃取分离的基础。PEG／无机盐双水相体系中，上相为富PEG相，下相为富盐相。无机盐的种类及浓度、PEG的分子量

8、以及溶液温度均影响双水相的形成。因蛋白质等电点存在差异，溶液pH值也影响双水相的形成和蛋白质分配。3．1无机盐种类的影响在15％PEGt条件下，考察了硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐对双水相成相的影响。实验表明，PEG均可与这些无机盐形成双水相。因Na：HPO-Nail：PO和(NH)SO具有成本低、用量少、溶解速度快、易成相且分相快速等优点，被经常使用。3．2pH值的影响对形成的双水相体系，调节pH值考察酸度对双水相体系稳定性的影响。结果表明，PEG／NaHPO一Nail：P