《核酸探针标记》PPT课件.ppt

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1、第9章核酸探针标记（labelofnucleiacidprobe）山东大学医学院免疫学研究所张利宁一、探针的类型核酸分子探针是指用放射性核素或其他标记物标记的、能与特定的靶分子发生特异性相互作用的DNA或RNA片段。1．基因组DNA探针：病毒DNA等2．cDNA探针；最常用3．寡核苷酸探针：10-50bp，测序、点突变4．RNA探针：稳定性高、特异性强，但RNA极易降解，不宜操作。二、探针的标记物理想的标记物：敏感度高；特异性强；不影响探针分子的主要理化特性；标记、检测方法简单、探针保存时间长；对环境无污染、对人体无损害；价格低廉。一）放射性标记物二）非放射性标记物（一） 放射性标记

2、物----放射性核素利用放射性核素能产生射线的特性将核素标记在核酸合成所必需的NTP或dNTP上，通过一定方法掺入到DNA或RNA中去制成探针，与待测的核酸杂交后，核素产生的或射线可使底片感光的特性，通过放射自显影的方法进行检测。产生射线的核素：32P、3H、35S产生射线的核素：125I1、常用的放射性核素1）32P：产生射线，灵敏度高，分辨率强，是最常用的放射性标记物，但半衰期短（14。3天）：位和位标记。2）35S：分辨率高、半衰期长（87。1天）。敏感度底O(S)O(S)O(S)OH-P-O-P-O-P-O-CH2O硷基OOOHH(OH)2、放射性标记物的优缺

3、点优点：灵敏度高：0。01pg特异性强缺点：放射性污染成本高、半衰期短，不能长期保存二）非放射性标记物1、优缺点优点：无放射性污染成本低、操作简单缺点：敏感性、特异性均低于放射性核素2、常用的标记物1）生物素：1-2pg生物素化核苷酸：bio-16-dUTPbio-11-dUTP生物素化核苷酸----通过酶触反应掺入到DNA中去制成探针----杂交----抗生物素蛋白-生物素-酶的复合物—加底物—显色光敏生物素：生物素与光敏基团结合----光敏生物素-----光敏生物素与核酸探针混合----在强光的作用下----光敏基团与核酸共价结合---生物素标记的探针生物素化的核苷酸和光敏生物素

4、生物素光敏基团2）地高辛甙元Dig-dUTP-----通过酶触反应掺入到DNA中去制成探针----杂交----加抗地高辛-酶的复合物—加底物—显色灵敏度较高：0.1pg特异性较生物素高是较理想的非放射性标记物三、探针的标记方法（一）缺口翻译法或切口平移法（二）随机引物法(三）末端标记法（四）cDNA探针的标记（五）RNA探针的标记（一）缺口翻译法或切口平移（nicktranslation）限量DNA酶IDNA聚合酶I+32P-dNTP变性32P部分标记的单连DNA片段5‘3‘3‘5‘5’-3外切酶和5’-3内切酶5’3’5’3’5’缺口翻译法的原理限量DNaseI在待标记的双连DNA的

5、每一条连上产生若干个单连缺口利用E.coliDNA多聚酶I的5’-3’外切酶的活性和5‘-3’多聚酶的活性，在缺口处5’末端每切除一个核苷酸，则在3’末端添加一个核苷酸，以修补缺口。随着缺口在5’末端的移动修饰的核苷酸就掺入到新合成的DNA连中缺口翻译法的特点1）快速、简便、标记的探针均一、特异性高2）仅适用于较长的双连DNA3）DNA多聚酶必须是E。ColiDNA多聚酶的全酶4）DNA酶I的浓度一定要适宜（二）随机引物法（random　priming)随机寡核苷酸引物（randomprimer)：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应引物

6、的作用E。coliDNA聚合酶I的Klenow大片段（仅具有5-3多聚酶的活性，而无外切酶的活性）随机引物法标记的原理变性后的探针DNA或RNA与随机引物混合随机引物按碱基互补的原则与模板DNA的相应区域结合DNA多聚酶I的Klenow大片段即从引物3’-OH端开始合成互补DNA连反应中若加入修饰的dNTP即可获得标记的DNA探针5‘3‘3‘双连DNA变性随机引物Klenow大片段32P-dNTP3‘5‘变性随机引物标记法随机引物法的特点1）不但可用于双连DNA的标记，而且可用于单连DNA和RNA的标记2）操作简单3）标记率高(三）末端标记法末端脱氧核苷酸转移酶法（terminald

7、eoxynucleotidetransferase)5’——DNA——3’OH+-32p-dNTP5’________DNA___________3’(pdN)n+nPPi(焦磷酸）T4多核苷酸激酶法（methodofT4polynucleotidekinase)末端转移酶(三）末端标记法T多核苷酸激酶法（methodofT4polynucleotidekinase)3’——————5’OH+32P-P-PA(ATP）————————5’32