核酸探针描述演示教学.ppt

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1、核酸探针描述第一节核酸探针杂交的基本理论一、变性与复性2DNA的变性(denaturation)：在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。34解链温度（融解温度，Tm）(meltingtemperature)：使50%的DNA发生变性时的环境温度。DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。56增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。7DNA的复性（renaturation)：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双

2、螺旋结构的过程。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。89减色效应：变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少的现象。101.常用的变性方法：①热变性②酸碱变性③化学试剂变性112.影响复性的因素①序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快②DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢③离子强度↑→有利于复性④DNA浓度↑→复性↑Tm值的估算①<20bpTm=4（G+C）+2（A+T）②>20bpTm=69.3+0.41(G+C)%③Tm=81.5℃+16.6lgM+0.41（G+C）%-

3、500/n-0.61×（甲酰胺%）12核酸杂交：不同来源的两条核酸单链由于具有互补序列，在一起复性时，互补序列配对，形成杂化分子。++131415二、影响杂交的因素1.核酸分子的浓度和长度2.温度：比Tm低25℃~30℃较适宜3.离子强度：离子强度↑→杂交反应率↑164.杂交液中的甲酰胺甲酰胺能降低核酸杂交的Tm，含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能降低到30—42℃。使用甲酰胺的优点：①低温下探针更稳定；②能更好地保留非共价结合的核酸。17注意：①待测核酸顺序与探针顺序同源性高的杂交，用水溶液时取68℃，用50%甲酰胺溶液时取40℃。

4、②待测核酸顺序与探针同源性不高时，以50%甲酰胺溶液在35—40℃杂交。185.核酸分子的复杂性直接影响复性几率。6.非特异性杂交反应：在杂交前将非特异性位点进行封闭，以减少对探针的非特异性吸附作用。常用封闭物：①变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA，小牛胸腺DNA②高分子化合物：Denhardt溶液脱脂奶粉19第二节核酸探针一、探针的选择原则1.高度的特异性2.制备探针的难易性和检测手段的灵敏法二、探针的种类201.基因组DNA探针从基因组DNA文库中选取某一基因片段↓与载体连接（质粒、噬菌体）↓克隆(PCR扩增)↓酶切优点：①无性繁殖、制

5、备方法简单；②不易降解（与RNA比较）；③标记方法成熟。212.cDNA探针（complementaryDNA）↓S1核酸酶切平两端优点：不含内含子及高度重复序列但不易获得↓载体连接↓克隆通过逆转录↓双链cDNA加接头↓限制酶粘性末端223.RNA探针：检测DNA和mRNA优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性杂交较少,未杂交探针可用RNase降解，减少本底的干扰。缺点：易降解，标记方法复杂234.寡核苷酸探针优点：①可根据需要合成相应序列；②探针短,序列复杂性低,分子量小，因此杂交时间短;③长度只有10—50bp，该识别序列内1个碱基的变

6、化可明显降低杂交Tm值。④可大量合成，价格低，能够用酶学或化学方法进行非放射性标记。24三、探针设计原则：①长度：10~50bp②碱基成分:G+C含量为40%~60%③探针分子内无互补序列。④避免同一碱基重复出现。⑤一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因序列进行同源性比较，与非靶区域的同源性不应超过70%或有连续8个或更多的碱基同源。25四、探针标记物的选择理想的标记物：①具有高度的灵敏性②与探针结合后，不影响杂交及探针的主要理化特性③检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率低，环境污染少，价格低廉；④若用酶促方法标记，应对Km影响不大26

7、（一）常用的放射性标记物常用探记探针的同位素：32P、3H、35S、14C、125I、131I272.特性：①检测特异性强；②灵敏度高；③对酶促反应无任何影响，也不影响碱基配对的特异性和稳定性；④易造成放射性污染；⑤半衰期短的同位素应用受到限制，随用随标记，立即使用，不能长时间存放。283.探针标记的方法①缺口平移法（nicktranslation）实质：用[α-32P]dNTP取代原来DNA链中不带同位素的同种核苷酸，生成的两条链均被同位素标记。2930②随机引物法（randompriming）人工合成的6~8个核苷酸长的各种不同排列顺

8、序的混合物，它们可以随机地互补到DNA探针的某一处，作为引物，在Klenow片段作用下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应液中加入[α-32P]dATP时，即可形成放射性同位素标记的DN