根癌农杆菌介导ipt基因转化甘蓝型油菜.pdf

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterGenetictransformationof驷fgeneintorapeseed(BrassicanapusLJmediatedbyAgrobacteriumtumefaciensByDandanSunSupervisor：Prof．BaomingTianGeneticsBiologicalEngineeringDepartmentMay2011原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行

2、研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文懈否／3坍丹日期．力。f『年石月／7日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩

3、印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文惜引艏日期：2．-oH年∥月／7日—————————————1。。。。。。。________一摘要油菜不仅是我国，同时也是世界上重要的经济作物和主要的食用油来源，是仅次于大豆的重要植物油脂的来源，也是当今世界上发展最快的多用途作物之一。目前，我国的油菜栽培面积、产量虽均居世界首位，但其单产却远远低于德国、丹麦等欧洲高产国家。近几十年来，随着人口的不断增加

4、，环境的急剧恶化及耕地的逐渐减少，人口与土地之间的矛盾也日益加剧。因此，培育出超高产油菜成为当下我国油菜生产最主要的研究任务。但是由于常规的遗传改良育种方法所需的时间较长，工作量大，天然突变体难以发现，诱变育种具有不确定性，并且发展潜力也相当有限等因素，所以人们已经开始寻求其它能突破常规育种障碍的新技术。随着分子生物学的不断发展和转基因技术的日趋成熟，利用基因工程技术获得期望的优良作物品种已成为现阶段遗传改良工作者首选的育种途径。细胞分裂素能促进营养物质的定向运输，在种子和果实的发育过程中能促进坐果，影响果实和种子中同化物的积累，

5、此外还具有促进胚乳的发育，以及具有增大果体的功能。因此利用基因工程手段，调控内源细胞分裂素含量，为进一步提高油菜产量提供了新的方向。本实验利用ipt基因(细胞分裂素合成关键酶基因)与Napin(油菜种子储藏蛋白)基因的启动子融合构建的、在种子发育时期，特异表达的ipt基因植物双元表达载体，介导油菜遗传转化，使得ipt基因在油菜种子的发育时期特异性高效表达，以期增加油菜种子形成时期内源细胞分裂素的含量，从而提高营养物质向种子定向运输的效率，为提高油菜的灌浆速度，进一步培育出超高产油菜种质奠定基础。研究的主要内容和结果如下：1、甘蓝型

6、油菜无菌苗培养体系的建立种子洗去表面浮土和残种后，75％酒精洗涤45s～lmin，无菌水洗2～3次，0．I％HgCl2浸泡10min，无菌水洗5~6次，浸泡5h后，接种于种子发芽培养基：MS培养基+3％蔗糖+0．7％琼脂，pH5．8，成苗率达100％，污染率为0(此处数据皆为以中双8号为实验材料时的数据)。2、以子叶和下胚轴为外植体的高频再生体系建立以苗龄4~7天的油菜子叶和下胚轴为外植体，接至分化培养基：MS+3mg／L6-BA+0．02mg／LNAA+3％蔗糖+0．7％琼脂粉，pH5．8，可直接再生出芽，且再生I摘要频率达到1

7、00％；接至生根培养基：1／2MS+3％蔗糖+o．8％琼脂粉+0．2mg／LNAA，pH6．1，生根率亦达到100％。3、有效抑制子叶和下胚轴愈伤分化的筛选压浓度的确定将油菜无菌苗子叶和下胚轴分别接种到有不同PPT浓度的分化培养基中，并测试其对愈伤诱导所产生的抑制效果。结果发现，抑制油菜外植体愈伤分化的筛选压PPT浓度为15mg／L。4、根癌农杆菌介导的油菜遗传转化体系的建立油菜的最适转化条件：切取油菜无菌苗的带柄子叶，柄长O．1-4)．2cm，下胚轴长约O．5cm，以OD600=0．3的农杆菌菌液感染子叶6,-8min，下胚轴O

8、．5～lmin，暗培养3d后，用含500mg／，LCef的MS液体培养基振荡脱菌，无菌水冲洗蜥次后，用无菌滤纸吸干其表面水分，然后接入延迟培养基上，延迟筛选6d后，转入分化筛选培养基上进行筛选，得到长约1-2era左右的的芽时，将其切下接入生根培养