基因工程8-DNA诱变(完整).ppt

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1、第十章DNA诱变突变是研究基因结构与功能的最基本手段。经典方法：分离自发突变体或用物理、化学诱变剂处理活体来获得突变，再根据突变体的表型，采用遗传学方法鉴定相应基因。体外诱变：对克隆化的DNA进行诱变处理，改变其核苷酸序列，从而获得突变基因，用于基因工程、蛋白质工程等研究。定向进化的原理第一节随机诱变体外随机诱变：指随机地在克隆化DNA中引入碱基置换突变。特点：不需要有序列针对性的合理设计，引入突变的位置随机；结果：在目的DNA片段中引入大量的序列多样性；方法：错误掺入诱变、增变菌株诱变、盒式诱变、化学诱变；用途：诱变基因的编码区，改变氨基酸序列，从而改造蛋白质的性质或活性，得到符

2、合需要的蛋白质。定向进化：对于某些实验目的，一次突变很难获得满意的结果，通常采用反复多次诱变和循环，其目的是获得满足人们需要的性能改良的蛋白质，又称为试管进化。一、错误掺入突变概念：在体外DNA扩增中，使用具有错配倾向的DNA聚合酶以及反应条件，使碱基错误掺入到新合成的基因中，又称易错PCR（error-pronePCR）。error-pronePCR的实质：通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中突变的频率，降低聚合酶固有的突变序列倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的DNA群体，最后用合适的载体克隆突变基因。易错PCR采

3、用的方法：增加MgCl2浓度到7mM，稳定非互补的碱基配对；加入0.5mM的MnCl2，Mn2+能降低聚合酶对模板的特异性；增加聚合酶量到5U，促使在错配碱基处继续延伸反应；限定4种碱基中的一种，通常为正常浓度的1-10%，在缺乏正确核苷酸时，DNA聚合酶经短暂停顿后，会插入另外3种可用核苷酸的一种；3种为正常浓度的正常碱基，第四种为次黄嘌呤dITP（可与C、T、A配对）；增加dCTP和dTTP的浓度到1mM，促进错误掺入；使用突变DNA聚合酶，如Mutazyme。二、盒式诱变盒式取代诱变混合寡核苷酸诱变盒式取代诱变种类简单的盒式取代诱变是通过限制性酶切除去特定的双链DNA片段，再

4、与含有突变的单一序列双链寡核苷酸连接,得到取代突变，是一种定点诱变。混合寡核苷酸诱变混合寡核苷酸诱变：若用于取代的是含有随机突变的混合双链寡核苷酸，则可在限定区域内引入大量的随机突变。三、增变菌株的诱变作用概念：与DNA错配校正功能和DNA损伤修复有关的基因突变后，细胞内基因的突变频率大大增加，这样的菌株叫增变菌株（mutatorstrain）。常用增变菌株：E.coliXL1-Red(mutDmutSmutT)mutD突变造成DNA聚合酶Ⅲ的3’→5’外切核酸酶活性缺陷，失去错配碱基的校正功能；mutS突变使DNA错配修复系统失去功能；mutT突变不能水解dGTP的氧化产物8-o

5、xodGTP，8-羟基鸟嘌呤在复制时掺入DNA中，造成突变。四、化学诱变用化学诱变剂处理双链DNA片段，将发生随机突变的片段群体克隆到合适的宿主中，构建成一个重组突变体库。用适当的功能分析可鉴别携带突变的重组子。常用的化学诱变剂：1.烷基磺酸盐和烷基硫酸盐——甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）2.亚硝基烷基化合物——亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚硝基-N-乙基脲烷（NEU）3.次乙胺和环氧乙烷类——乙烯亚胺（EI）4.芥子气类——氮芥类、硫芥类烷化剂作用机制——作用重点是核酸，导致DNA断裂、缺失或修补。这类化合物具有与DNA碱基类似的结构。代表药剂：5-溴尿嘧啶（BU）

6、、5-溴去氧尿核苷（BudR）为胸腺嘧啶（T）的类似物2-氨基嘌呤（AP）为腺嘌呤（A）的类似物马来酰肼（MH）为尿嘧啶（U）的异构体核酸碱基类似物亚硝酸能使嘌呤或嘧啶脱氨，改变核酸结构和性质，造成DNA复制紊乱。HNO2还能造成DNA双链间的交联而引起遗传效应。叠氮化钠(NaN3)是一种呼吸抑制剂，能引起基因突变，可获得较高的突变频率，而且无残毒。其它诱变剂作用机制——作为DNA的成份而渗入到DNA分子中去，使DNA复制时发生配对错误，从而引起有机体变异。第二节DNA体外重组依赖序列同源性的DNA体外重组技术。要求：DNA亲本序列之间要有一定程度的同源性，重组交换在局部序列完全

7、相同的片段内发生。关键：引入DNA片段的重新组装过程，又称有性PCR（sexualPCR）或分子育种PCR（molecularbreedingPCR）。优点：可以将大量突变中的有益突变快速地组合，加速产生DNA序列多样性，使定向进化从以往的“突变—选择”模式变为与自然进化更为相似的“突变—重组—选择”模式。一、DNA洗牌法（DNAshuffling）美国Stemmer于1994年首次提出。DNAshuffling技术是通过对一组序列相关DNA序列，经过超声波处理或在D