8-DNA（羟）甲基化

《8-DNA（羟）甲基化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、分子机制研究套路（八）DNA（羟）甲基化课题：C因素激活A蛋白对B基因启动子DNA甲基化的调控对D疾病的影响1．概念介绍：表观遗传学是当今生命科学普遍关注的前沿，是一种可遗传的调节基因表达的机制，不同于经典遗传学，不涉及到基因序列的改变,而且表观遗传修饰是可逆的，在基因调控中起重要作用。DNA甲基化是表观遗传学主要调控机制之一，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育、染色质结构改变以及人类疾病的发生、发展中起着重要作用。DNA甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）提供甲基、在DNA甲基转

2、移酶（DNAmethyltransferase,DNMT）的催化下，在胞嘧啶的C5位上面加上一个甲基，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化学修饰过程。DNA甲基转移酶(如DNMTs)与DNA去甲基化酶(如TET蛋白等)调控基因组DNA序列甲基化的动态变化，一般来说，基因启动子区CpG岛的甲基化可以使一些转录因子无法与DNA结合而抑制基因的转录，而该区域的去甲基化则可以激活基因的转录。DNA甲基化主要发生在CpG异二核苷酸上面（如示意图1），而CpG在人类基因组中出现的几率比较低，主要集中出现在CpG岛（CpGisland）上面。C

3、pG岛是指由200bp的碱基组成的DNA序列，其中GC含量占60%以上的一个区域，这个区域主要位于某些基因的启动子区域。CpG岛上DNA的甲基化是表观遗传学研究中的一个重点，其可改变染色体的结构、影响邻近基因的表达。高度甲基化的DNA与组蛋白结合紧密并且能够招募转录抑制因子、抑制转录激活因子与启动子区域的结合，从而达到抑制基因表达的目的；而DNA的低甲基化使得染色体结构松散，促进转录激活因子和RNA多聚酶与靶序列的结合，从而驱使相关基因的高表达。图1：DNA在CpG异二核苷酸上的甲基化示意图表观遗传学最先用于肿瘤的研究中。在许多

4、肿瘤细胞中发现CpG岛高度甲基化，从而抑制抑癌基因的表达，诱发肿瘤的产生，因此DNMT抑制剂5-氮胞苷（5-AZA）等被用于肿瘤的临床治疗。2．示意图：DNA甲基化循环的过程如图2：通过SAM提供甲基，在DNMT的催化下完成甲基化过程，于此同时会产生副产物S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine,SAH），SAH进一步转化为高半胱氨酸，而高半胱氨酸是这个循环中的关键组分，研究表明升高的高半胱氨酸能够损伤DNA的修复机制，诱导氧化应激，导致细胞死亡和中枢神经系统功能的紊乱。从循环图中可以得知，高半胱氨酸具有

5、2条去路，一方面可以形成甲硫氨酸重新参与甲基化循环，另一方面可以被分解代谢为半胱氨酸。高半胱氨酸转化为甲硫氨酸的过程是在甲硫氨酸合成酶的作用下完成的，但是需要维生素B12和5-甲基四氢叶酸的辅助，而5-甲基四氢叶酸又需要通过食物中的叶酸转化而来；高半胱氨酸转化为半胱氨酸也需要维生素B6的参与。已经发现维生素B6、维生素B12和叶酸的缺乏与高半胱氨酸水平升高密切相关，因此，可以通过食物疗法来保证维生素B12、维生素B6和叶酸的供应，达到防止疾病的目的。图2：DNA甲基化循环过程3．研究思路：3.1D疾病中B基因启动子调控序列甲基化

6、状态及其与B蛋白表达相关性分析43.1.1D疾病组与正常对照组细胞基因组DNA整体甲基化水平43.1.2D疾病和正常对照组细胞B基因启动子调控序列DNA甲基化水平.43.1.3D疾病和正常对照组细胞B蛋白表达水平及其与B基因启动子调控序列DNA甲基化水平相关性分析43.2补丁甲基化技术构建特殊报告载体检测DNA甲基化对B基因启动子转录活性的调控53.2.1成功构建B基因启动子调控序列PGL-3promoter荧光素报告载体53.2.2质粒PCR大量扩增B基因启动子调控序列片段53.2.3体外人工甲基化及甲基化敏感性限制性内切酶酶

7、切鉴定53.2.4检测CpG甲基化和未甲基化目的片段荧光素报告载体荧光素活性53.3A蛋白对B基因启动子DNA甲基化及转录活性调控的分子机制63.3.1A蛋白募集去甲基化酶TET2结合至B基因启动子序列63.3.2A蛋白促进细胞B基因启动子去甲基化63.3.3C因素促进细胞B蛋白表达63.1D疾病中B基因启动子调控序列甲基化状态及其与B蛋白表达相关性分析3.1.1D疾病组与正常对照组细胞基因组DNA整体甲基化水平用磁珠分选法分离10例D疾病患者及正常对照细胞，提取基因组DNA，用MethylampTM整体DNA甲基化检测试剂盒检

8、测D疾病与正常对照细胞基因组DNA整体甲基化水平。结果显示D疾病组细胞基因组DNA整体甲基化较正常对照组明显下降。注释：1）疾病组和对照组样品，如果可获得临床样本最好，如果没有，可用同一组织类型的疾病细胞系和正常细胞系。2）如果是临床样本，细胞的分离方法不一定是