一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法.doc

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1、一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法作者：李琴山冯赞杰刘洋徐海燕钱民章【关键词】，内皮细胞；脐静脉；细胞培养【Abstract】AIM:Toestablishastablemethodtoisolateandculturehunianiinibilica1veinendothelialcells(hUVEC)invitro.METHODS:Endothelialcel1sofveinfromnewbornumbilicalcordweresuccessfullyisolatedusingacombinationofcollagen

2、aseandtrypsin(1:1)・Cellswerenotdigestedwithtrypsinuntilthecellsreachedconfluenceover80%・Thecompositionofculturemediumwassimplifiedbynotaddingvascularendothelialcel1growthfactorandheparin.TheculturedcellswereverifiedashUVECbymorphologyandimmunofluorescencestaining・RESU

3、LTS:Theendothelialcellsinitiallyspreadonthebottomofthedishesin4h,thencoalescedandgrewtoformconfluentmonolayersofpolygonalcellswithin7-10d・Theculturedcellshadacobblestoneappearancewithastrictmonolayergrowthandcontactinhibition.Thepurityofendothelialcellswasmorethan95%i

4、dentifiedbyimmunocytochemistrystainingforVDI:AgandKDR.CONCLUSION:MethodofinjectionwithmixedEnzymesolutionisanoptimizedprotocolwhichisreliableandofhighachievementratio.Cel1sharvestedwiththisprotocolcanbeusedasmodelsonresearchofvascularendothelialcellsinvitroe[Keywords]

5、endothelialcel1;umbi1icalvein;cel1culture【摘要】目的：建立稳定的人脐静脉内皮细胞分离和培养的方法.方法：采用胰蛋白酶/胶原酶(1:1)混合酶液消化法培养人脐静脉内皮细胞，简化完全培养液组分(不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子)，当原代培养细胞80%以上汇合后用胰蛋口酶消化传代;用形态学、免疫细胞化学法进行鉴定•结果：种植在培养瓶中的内皮细胞4h贴壁生长，48〜96h生长最快，7〜10d汇合•内皮细胞呈单层铺路石样外观，VIII因子相关抗原(VHI：Ag)和内皮细胞生长因子受体2(K

6、DR)鉴定内皮细胞纯度达95%以上•结论：用混合酶液灌注脐静脉消化内皮细胞是获取内皮细胞的一种好方法，可靠性大，成功率高，可以构建体外研究血管内皮细胞的模型.【关键词】内皮细胞；脐静脉；细胞培养0引言血管内皮细胞(vascularendothelialcel1,VEC)在心血管疾病的发生中占有重要的地位[1]•釆用培养的VEC进行相关机制研究是一种普遍应用的实验方法.由于人体组织取材限制,很难获取大量原代培养的人VEC.我们以健康胎儿脐静脉血管为材料，建立起一种改良的人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendot

7、helialcells,hUVEC)培养方法.1材料和方法1.1材料新生儿脐带由遵义医学院附属医院提供；胰蛋白酶、II型胶原酶、EDTA（Sigma公司）；M199、胎牛血清（Gibco公司）；台盼蓝（Amresco公司进口分装）；鼠抗人VHI因子抗体、鼠抗人内皮细胞生长因子受体2（KDR）抗体（美国Dako公司）；超净台（苏州苏净集团安泰空气公司）、倒置相差显微镜（曰本Nikon公司），C02孵箱（美国ThermoFormo公司）、酶标仪（德国HumaReader公司）•完全培养液为800mL/LM199培养液、200mL/L胎

8、牛血清、2mmol/LL谷氨酰胺、1X105U/L青霉素、100mg/L链霉素,使用前调节pH至7.0、7・4.1.2方法1.2.lhUVEC的分离和培养在无菌条件下，取健康产妇分娩后6h内［2］的脐带，长约30cm,剪去脐带两端钳夹处•于脐静脉一