DB34∕T 3121-2018 Ⅰ群血清4型禽腺病毒核酸PCR检测技术规程.pdf

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1、ICS11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T3121—2018Ⅰ群血清4型禽腺病毒核酸PCR检测技术规程TechnicalRegulationsofPCRAssayforDetectionofFowlAviadenovirusSerotype4NucleicAcid文稿版次选择2018-04-16发布2018-05-16实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T3121—2018前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由阜阳市畜牧兽医局提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：阜阳市立华畜禽有限公司、阜阳市动物疫病预防与控制中心、

2、阜阳市畜牧兽医局、颍东区畜牧兽医局、阜阳市动物卫生监督所。本标准主要起草人：孟宪臣、张海涛、郭强、李东风、桑晓媛、高树朋、高永士、潘五岳、郑玉才、罗燕、刘新、薛亚梅、吴含萍、张娟娟。IDB34/T3121—2018Ⅰ群血清4型禽腺病毒核酸PCR检测技术规程1范围本标准规定了Ⅰ群血清4型禽腺病毒核酸PCR检测技术。本标准适用于对活禽肛拭子和病死禽肝脏进行Ⅰ群血清4型禽腺病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用

3、要求GB/T21674猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法3缩略语以下缩略语适用于本文件。FadV（FowlAviadenovirus）：Ⅰ群禽腺病毒。FAdV-4（FowlAdenovirus-4）：Ⅰ群血清4型禽腺病毒。PCR（PolymeraseChainReaction）：聚合酶链式反应。DNA（DeoxyribonucleicAcid）：脱氧核糖核酸。ExTaq酶：从水生栖热菌ThermusAquaticus（Taq）中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶，ExTaq酶是其中的一种。PBS（PhosphateBufferSolution）：磷酸盐缓冲液。SPF（SpecificP

4、athogenFree）：无特定病原。4主要仪器4.1高速台式冷冻离心机4.2生物安全II级通风柜4.3PCR扩增仪4.4核酸电泳仪4.5微量移液器（2μL、10μL、100μL、1000μL）4.6超低温冰箱4.7核酸凝胶成像系统4.8高压蒸汽灭菌锅4.9电热恒温鼓风干燥箱4.10微量振荡器1DB34/T3121—20185主要试剂5.1消化液(见第A.1章)5.22％蛋白酶K溶液（见第A.2章）5.3酚-三氯甲烷-异戊醇混合液（见第A.3章）5.475％乙醇（见第A.4章）5.5GoldView核酸染料5.6上游引物P1：FAdV-4（10μM）5.7下游引物P2：FAdV-4

5、（10μM）5.8琼脂糖（分析纯）5.950×TAE缓冲液（见第A.5章）5.10PBS（见第A.6章）5.11DL2000DNAMarker（见第A.7章）5.1210×LoadingBuffer（见第A.7章）5.13双蒸水（符合GB/T6682要求）5.14PCR用ExTaq（见第A.8章）5.1510×ExTaqbuffer(Mg2+plus)（见第A.8章）5.16dNTPMixture（见第A.8章）6引物根据GenBank登录的FAdV-4(GenBank:GU188428.1)Hexon基因核苷酸序列，设计用于扩增FAdV-4的PCR引物，FAdV-4上游引物P1：

6、FAdV-4（5'-GACCGTTACAAGTTTAGCATCTCC-3'），FAdV-4下游引物P2：FAdV-4（5'-TCGCAGGAAGTCGTAGTGGA-3'），扩增核酸片段大小为951bp。如果制备的核酸模板中有FAdV-4，PCR产物电泳后在951bp处出现条带，即为阳性，反之即为阴性。7样品的采集和处理7.1采样工具7.1.1棉拭子和1.5mL离心管，经121℃高压灭菌15min，烘干。7.1.2剪刀、镊子和研磨器，经160℃干热灭菌2h。7.2样品采集7.2.1活禽取泄殖腔拭子，采集方法如下：——取泄殖腔拭子时，将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便；——将拭子一

7、并放入盛有1.0mL含双抗PBS（高压冷却后的PBS，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000IU/mL）的1.5mL离心管中，加盖标记。7.2.2病死禽病死禽剖检并取肝脏装入一次性塑封袋或其他灭菌容器，标记，送实验室。2DB34/T3121—20187.3样品储运样品采集后，放入密闭的塑封袋内（一个采样点的样品，放在一个塑封袋内），于保温箱中加冰、密封，24小时内进行样品处理。7.4样品处理7.4.1泄殖腔拭子样品在震荡器上充分混合后，取上清液转入无菌的1.5mL离