行业标准：DB37T 3128.2-2020 Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术 第2部分：血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染PCR和荧光定量PCR诊断技术.pdf

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1、ICS65.020.30B41DB37山东省地方标准DB37/T3128.2—2020Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术第2部分：血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染PCR和荧光定量PCR诊断技术DiagnostictechniquesforfowladenovirusgroupIPart2:DetectionmethodonfowladenovirusgroupIserotype4byPCRandquantitativereal-timePCR2020-06-08发布2020-07--08实施山东省市场监督管理局发布DB37/T3128.2—2020前言本标准按照GB/T1.1－2009

2、给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：刁有祥、唐熠、杨晶、王鸿志、陈浩、冯强、张吉、宋存鑫、李伟。IDB37/T3128.2—2020Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术第2部分：血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染PCR和荧光定量PCR诊断技术1范围本标准规定了血清4型Ⅰ群禽腺病毒聚合酶链式反应（PCR）与实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法的范围、规范性引用文件、术语和定义、实验室要求、样品、结果判定等。本标准所规定的血清4型Ⅰ群禽腺病毒PCR与实时荧光定量PCR检测方法适用于检

3、测鸡组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液及细胞培养液中血清4型Ⅰ群禽腺病毒的核酸，也适用于鸭、鹅及鸭胚、鹅胚尿囊液血清4型Ⅰ群禽腺病毒核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1血清4型Ⅰ群禽腺病毒FowladenovirusgroupISerotype4是引起禽心包

4、积水-肝炎综合征的病原，主要造成3周龄～5周龄家禽突然死亡，并伴随有心包积水和肝炎。3.2实时荧光定量PCRQuantitativeReal-timePCR（qPCR）通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。4实验室要求4.1环境4.1.1实验室符合GB19489和GB/T27401要求，实验室必须为生物安全Ⅱ级（BSL-2级）及以上实验室。1DB37/T3128.2—20204.1.2从事PCR工作的实验室应进行分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩

5、增区、电泳检测区，形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。4.1.3生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后，送有资质的医用垃圾处理公司做处理。4.2人员操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术，熟悉PCR与qPCR检测结果的判断方法。4.3仪器设备4.3.1生物安全柜。4.3.2PCR仪（温度差小于0.3℃）。4.3.3台式低温高速离心机（最大转速为15000rpm）

6、。4.3.4电泳仪。4.3.5电泳槽。4.3.6紫外凝胶成像仪。4.3.7冰箱：2℃～8℃。4.3.8冰柜：-20℃。4.3.9微量移液器（最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL），带滤芯的枪头。4.3.10电子天平：精度为0.001g。4.3.11电磁炉或微波炉。4.3.12荧光定量PCR仪。4.4试剂或材料除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯，水符合GB/T6682规定的一级水。4.4.1DNA提取试剂盒。4.4.2rTaqDNA聚合酶：5U/μL。4.4.310×PCR缓冲液。4.4.4dNTPs：2.5mmol/L,10mmol/L。4.4

7、.5荧光定量PCR试剂盒。4.4.61.5%琼脂糖凝胶，见附录A.1。4.4.71×TAE缓冲液，见附录A.2。4.4.8溴化乙锭（10μg/μL），见附录A.3。4.4.9核酸电泳加样缓冲液，见附录A.4。4.4.10DNA分子量标准，要求在100bp～2000bp之间，有5条以上的指示条带。4.4.11阳性对照标准品，已知的血清4型Ⅰ群禽腺病毒SPF鸡胚尿囊液。4.4.12阴性对照标准品，经高压灭菌的超纯水。2DB37/T3128.2—20204.4.13PCR检测所需引物：——上游引物F：5’-CTCTTCGACCTCGTGTCTTACA-3’