固相膜免疫分析技术.ppt

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1、第十一章固相膜免疫分析技术徐广贤目录第一节概述第二节免疫层析试验第三节免疫渗滤试验第四节斑点酶免疫吸附试验第五节免疫印迹试验第六节影响固相膜免疫试验的主要因素第七节固相膜免疫分析技术的临床应用第一节概述重点提示固相膜免疫分析技术常用的固相膜和标志物固相膜的技术要求固相膜免疫分析技术是以微孔膜为固相载体，包被已知抗原或抗体，加入待测样本后，经微孔膜渗滤作用或毛细管虹吸作用使样本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金标记物或酶标记物与之反应形成肉眼可见的显色结果。常用的固相膜玻璃纤维素

2、(fiberglass)膜尼龙（nylon）膜硝酸纤维素（nitrocell-ulose，NC)膜NC膜或尼龙膜是常用的固相膜常用的标志物酶和有色微粒子彩色胶乳荧光素胶体金和胶体硒等其中以胶体金和荧光素最为常用固相膜的技术要求孔径：穿流法的膜一般选择0.4μm左右；横流法的膜可选择5μm〜10μm。流速：孔径和分布结构影响膜的流动速率，孔径大，流速快。蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示。均一性：优质的膜具有良好的均一性。第二节免疫层析试验重点提示原理常用的免疫层析试验胶体金免疫层析试验的

3、测定模式荧光免疫层析试验技术要点原理免疫层析试验是以硝酸纤维素膜为固相载体，样品溶液借助毛细作用在层析条上泳动，同时样品中的待测物与层析材料上待测物的受体（抗原或抗体）发生高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过检测标记物胶体金颗粒或荧光素等，在短时间内（20min)聚集而得到直观的试验结果（显色）。常用的免疫层析试验根据标记物的不同，免疫层析试验可以分为：胶体金免疫层析试验：标记物为胶体金，多用于检测抗原，但亦可用于检测抗体。荧光免疫层析

4、试验：标记物为荧光素，标记相应的抗体或抗原，然后利用荧光检测仪检测试剂条上富集的反应结合物激发产生的荧光强度，从而对标记物浓度进行检测的一种方法。胶体金免疫层析试验的测定模式双抗体夹心法检测大分子抗原竞争法检测小分子抗原间接法双抗体夹心法检测大分子抗原G处为金标特异性抗体，T处为包被特异性抗体，C处为包被抗免疫球蛋白抗体，B处为吸水纸。测试时A端滴加待测标本，通过层析作用，待测标本向B端移动，流经G处时将金标抗体复溶，若待测标本中含待测抗原，即形成金标抗体-抗原复合物，移至T区时，形成金标抗体-抗

5、原-抗体复合物，金标抗体被固定下来，在T区显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标记抗体移至C区被抗金标抗体捕获，呈现红色质控线条。图11-1免疫层析试验双抗体夹心法原理示意图竞争法检测小分子抗原图11-2免疫层析试验竞争法原理示意图G处为金标抗体，T处包被标准抗原，C处包被抗金标抗体，测试时待测标本加于A端，若待测标本中含有待测抗原，流经G处时结合金标抗体，当混合物移至T处时，因无足够游离的金标抗体与膜上标准抗原结合，T处无红色线条出现，实验结果为阳性，游离金标抗体或金标抗体复合物流经C处，与该处的

6、抗金标抗体结合出现红色的质控带，若标本中不含待测抗原，金标抗体则与T处膜上的标准抗原结合，在T处出现红色的线条，实验结果为阴性。间接法利用间接法检测抗体时，待测血清标本中大量的非特异性IgG可以与特异性IgG竞争性结合胶体金标记的抗人IgG，从而影响试验的敏感性，为了消除其影响，常采用反流免疫层析法排除非特异性抗体对测试的干扰。荧光免疫层析试验荧光免疫层析试验是在免疫层析技术的基础上，采用荧光素标记相应的抗体或抗原，然后利用荧光检测仪检测试剂条上富集的反应结合物激发产生的荧光强度，从而对标记物浓度

7、进行检测的一种方法。荧光免疫层析实验与胶体金免疫层析实验的基本步骤是一样的，但所用的标记物不一样，前者采用的是荧光素，后者采用的是胶体金。常用的方法有夹心法、竞争法等。技术要点胶体金层析试验：加样、结果判定。荧光层析试验：不同的荧光标记物具有不同的检测波长，需根据试剂盒的荧光标记物的特性，选择合适的检测波长，或使用试剂盒提供的专用荧光检测仪器。第三节免疫渗滤试验重点提示原理测定模式技术要点原理DIGFA是将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，制成抗原或抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上，依

8、次在膜上滴加样品、免疫胶体金及洗涤液等试剂并与硝酸纤维素膜上的相应抗原或抗体发生反应，起到亲和层析的浓缩作用，达到快速检测的目的。抗原抗体反应后，形成大分子胶体金复合物，从而使阳性结果在膜上呈现红色斑点。测定模式1.双抗体夹心法测抗原：AB包被抗体的试纸滴加金标抗体滴加待检样品于试纸上测定模式2.间接法测特异性抗体：试剂盒组成主要由渗滤装置、胶体金标记物、洗涤液、抗原参照品或抗体阳性对照品四部分组成。其中渗滤装置是由塑料小盒、吸水垫料和已点加抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。试