YC-T 149-2002 烟草及烟草制品 转基因的测定.pdf

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1、ics65.160%85备案号:10586-2002中华人民共和国烟草行业标准YC/T149-2002烟草及烟草制品转基因的测定Tobaccoanditsproduct-Determinationofgeneticallymodifiedorganism2002一09门2发布2002一12一01实施国家烟草专卖局发布647YC/T149-2002前言本标准由全国烟草标准化技术委员会农业分技术委员会提出。本标准由全国烟草标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国烟草东北农业试验站。本标准主要起草人:焦庆明、郭兆奎、闻新甫、万秀清、于艳华、魏继承。YC/T14

2、9-2002烟草及烟草制品转基因的测定范围本标准规定了烟草及烟草制品转基因的测定方法。本标准适用于烟草及烟草制品。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1基因工程geneticengineering利用载体系统的重组DNA技术，以及利用物理、化学和生物等方法把重组DNA导人有机体的技术。2.2转基因烟革geneticallymodifiedtobacco利用基因工程的遗传操作获得的烟草，不包括自然发生、人工选择和杂交育种技术得到的烟草;不包括化学或物理方法诱变得到的烟草;不包括通过器官、组织或细胞培养及原生质体融合、染色体倍性操作得到的烟草。3实验室

3、要求3.1实验室空间设计应在相互隔离的不同实验室进行样品前处理、DNA提取、PCR反应、试剂配制和凝胶观察等操作，并定期对实验室进行紫外过夜照射。3.2操作要求试验室台面使用前后利用次抓酸钠擦拭消毒;样品研磨在强力通风橱中进行;PCR反应液加样在超净工作台内进行;样品准备过程中每个样品操作更换一次塑料手套;样品的称量不可在称量试剂的天平室内进行，应设专用天平以免污染试剂。3.3样品皿盆将每个待测样品随机分成两组，每组分别进行DNA提取和PCR分析。3.4对照样品3.4.1阳性对照阳性标准样品是配制为已知含量的转基因烟草样品，确定其含量分别为0.1%.0.5

4、0o,1%.2写、s%e3.4.2阴性对照阴性对照是事先检测为非转基因的烟草样品。3.4.3试荆对照该对照中不含烟草样品，与样品一起利用相同的程序进行各种试剂的处理操作，用以控制反应试剂对试验结果的影响。YC/T149-20023.4.4提取空白从样品研磨到提取结束，将两个离心管放在工作区内，与样品DNA一起进行PCR扩增，以确定交叉污染的可能性。3.5PCR扩增结果观察在每一次PCR反应中，只有当所有的对照都表现正常时，才能认可电泳结果，此时阳性样品在特定位置出现一条带，而其他位置及阴性对照和空白对照都没有扩增条带。若任何对照出现异常，要重新进行检测，以

5、避免假性结果。3.6防止污染所有用于提取DNA和PCR扩增的耗材、用具使用前都必须进行灭菌处理，移液器枪头和各种离心管只能一次性使用，工作台面和操作间用过后进行紫外线过夜照射，样品前处理及研磨要在通风橱中进行，并带一次性手套.3.了安全防护在整个试验操作过程中都必须穿着工作服和手套，特别在接触EB时应带抗化学腐蚀的手套及口罩。4试荆4.1化学试荆以下试剂均为分析纯以上纯度等级。4.1.1十六烷基三甲基澳化胺CTAB,4.1.2三抓甲烷。4.1.3乙二胺四乙酸二钠NazEDTA,4.1.4乙醇。4.1.5抓化钠。4.1.6三经甲基氨基甲综碱TrisBase,

6、4.1.7乙烯毗咯烷酮PVP-40,4.1.8异戊醇。4.，.9琼脂糖。4.1.10硼酸。4.1.11嗅酚蓝。4.1.12冰乙酸。4.1.13澳乙锭.4.1.14乙酸钠。4.1.15盐酸。4.1.16柠檬酸钠。4.1.17十二烷基硫酸钠SDS,4.2生物化学试剂4.2.1PCRMarker,4.2.2TaqDNA酶2u/mL,4.2.3限制性内切酶Asp700(Xmnl),Nsil,4.3缓冲液4.3.1CTAB提取缓冲液(pH8)含CTAB(q=20g/L),NaCI(c=1.4mol/L),Tris(c=0.1mol/L)和Na2EDTA(c=20mm

7、ol/L)a4.3.2CTAB沉淀缓冲液含CTAB(q=5g/I)和NaCI(c=0.04mol/L),4.3.3高盐TE含NaCl(c=1.2mol/L)YC/T149-20024.3.4DNTPs含dATP,dCTP,dTTP和dGTP各2.5mmol/L,4.3.5AE缓冲液(pH7.85)含Tris(c=40mmol儿)、乙酸钠(c二20mmoi/L)和Na,EDTA(c=2mmol/L),4.3.6TBE缓冲液(pH8.0)含Tris/翻酸(c=45mmol/L)和Na,EDTA(c=1mmol/L),4.3.7标记的DNA探针。4.3.82XS

8、SC缓冲液(pH7.0)含NaCl(c=3mol/L)和乙酸钠(c