细胞培养有关知识.doc

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1、PBS(Phosphatc-BuffcrcdSallines)KCI0.20gKH2PO40.20gNaCI8.00gNa2HPO4-7H2O2」6gDPBS(Dulbecco^Phosphate-BufferedSallines)标准型CaC12(anhyd.)(无水氯化钙)0.1OgKCI0.20gKH2PO40.20gMgC12-6H2O0.1OgNaCI&00gNa2HPO牛7H2O2.16gD-Hanks9平衡盐溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)KCI0.40gKH2PO40.

2、06gNaCI&00gNaCO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucosel.OOgPhenolRed0.0Ig胰蛋白酶溶液配制：称取胰蛋片酶粉末置烧杯屮，用少许D-Hanks平衡盐(或PBS)溶液调成糊状，再补足D-Hanks平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡次L1,过滤除菌，分装入瓶屮，・20°C保存备用(以免分解失效)，常用浓度为0.25%(0.1%-0.5%)o如果短期内要使用，就放置4°C冰箱。胰蛋白酶%1酶的活力：新鲜配制，低温保存%1酶的浓度为0.1%-0.25%%1温度常川的温度

3、为37°C。%1pH选用&0-9.0Z间。%1无机盐离了钙和镁可抑制胰酶的消化作用，配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。%1消化时间20分钟为宜，冷消化时可使用低浓度消化液4°C过夜。pH调整液：NaHCO3溶液常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后,过滤除菌或高压灭菌,分装，4"C保存抗生素溶液通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液青霉索主要是对革兰阳性菌有效，链霉索主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生索可预防绝大多数细菌污染。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。抗菌素液（青、链霉素：）:青、链霉素：最

4、终浓度为青霉素100U/ml,链霉素100U/mlo一般市伟市伟链霉索为100力U/瓶，将其溶解在10mlHanks液或三蒸水屮，取8ml链霉索液溶解80力-U/瓶青霉素，即成为青霉素、链孫素各1.0xl05U/ml的母液.使用时每100ml培养液屮加0.1ml,即成最终浓度为100U/mlo细胞培养基应用选择：根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选RPMI1640o合成培养基的配制:①滤器、滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒（容量瓶）、贮液瓶（生理盐水瓶）、瓶塞、注射器。②NaHCO3、NaOH、HC1、胎牛

5、（小牛）血清、青霉素、链霉素、三蒸水、培养粉①恥制培养基需新制备的三蒸水，一般在配制当天或前一天制备为最好，这样可以保证水的纯度和质量。调节培养液pH值的HC1和NaOH溶液也需用这种水配制。配制培养基的备种器皿都应做到绝对干净，烤干后使用（专用）。将干粉型培养基溶于总量1/3的水屮，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液屮，以保证所有干粉都溶解成培养液。培养液屮加入磁性搅棒，把盛培养液的器川L放在磁力搅拌器上搅拌,补加水到最终量。培养液配制过程屮一般不需加热助溶。根据包装袋上的要求和实验需要补加NaHCO3和谷氨酰胺。加抗生素：上述

6、溶液配制好后，用过滤法消毒除菌，采用0.22pm和0.45pm滤膜各1张。分装于玻璃瓶屮，使用时再加血清。取样培养2U以检测污染（防止污染的处理：检杳过滤装置3次。每次操作烧瓶口）使用加入牛血清、抗菌素培养操作有关器皿玻璃瓶：主要用于存放或配制各种培养用液体如培养液、血清及试剂等。吸管：主要有刻度吸管及尖吸管。刻度吸管主要川于吸取、转移液体，尖吸管又有直头吸管及弯头吸管Z分，除可作吸取、转移液体外，弯头尖吸管还常用于吹打、混匀传代细胞。加样器：用于吸取、移动液体或滴加样木。常用微星加样器，可保证实验样品含量精确，重复性良好。