marc 145细胞培养和维持有关资料综述.doc

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1、Marc145细胞培养和维持有关资料综述一、细胞及培养1>Marc145细胞上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA104细胞）克隆而得到，可连续培养。2、生长培养基DMEM（高糖型，含4500mg/LD—葡紬糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠）+5-10%新生牛血清+1%双抗（青霉素和链霉素）的培养液。3、冻存液生长培养基+10%DMSO4、细胞健康生长的几项注意事项（1）细胞没有支原体等外源因了的感染。（2）培养液的pH値可在7.0-7.3,以7.2为佳。（3）一般按1

2、：3传代，细胞接种密度为1-1.5x105cells/ml,48hr后长成单层。（4）培养基和血清的质绘可靠、稳定；建议采用特级小牛血清。（5）细胞及时传代，不可以在老化后传代，一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。（6）细胞传代时消化液用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA，消化过程应尽量缩短在1〜2分钟内完成。二、病毒感染、维持和收获恒温室转瓶机上旋转培养3—5天。维持液：DMEM+4〜5%新生牛血清。pH应为7.4〜7.8；后期维持pH会慢慢降下来。细胞病变时间出现在接毒后48小时，72〜

3、96小时细胞病变达80%左右，当细胞出现80%以上病变(CPE)时，即可开始收毒；反复传过几代后病变时间可缩短。第3、4天注意观察，细胞病变(CPE)达到80%时收获病毒，一20"C冻融3次，混匀病毒悬液，96孔板测定TCID50o收液时需要将含毒细胞反复冻融2〜3次以破碎细胞，将病毒释放到培养液屮。三、细胞病变(CPE)细胞在接种病毒后，24—48hr开始出现病变，72—96hr约达到80%病变。病变现象：细胞空泡化、圆缩、先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎。图1是指PRRSV感染后

4、，出现细胞病变的Marc145细胞。四、PRRS病毒在细胞中增殖规律(VirologyJournal,2006,3:90)PRRS病卷感染Marc145细胞过程可大致分为两个感染阶段，第一阶段：病毒感染细胞后的20—22hr左右，仅部分细胞被随机感染，而且Marc145细胞对PRRS病毒的低感染性(lowpermissiveness)◎MOI量无关，因为MOI剂星比常规星捉高100倍，感染22hr后，仍仅5.5%的细胞呈PRRSV阳性(PRRSV-positive)。第二阶段：感染后的2-3沢(也

5、称为病毒的对数感染期),病毒感染蔓延是通过相邻细胞和细胞Z间的接触感染，细胞对口由病毒不敏感(CellsisnonpermissivetofreeVirus),并出现了感染细胞群。感染过程如图5所示。对我们的一点启示:可以采用适当低量的MOI进行病毒感染,比如0.05virus/cell；同时，大部分细胞在维持期的第一天尚需继续生长，而且病卷在2_4天才是感染、增殖的高峰,较长的病毒维持期均需耍供给丰富的营养物资，对以相信：维持液的营养成分对病毒增殖效率有沖常重耍的影响。Marc-145细胞消化问

6、题MARC145消化时间和细胞密度有关系的，对于一个T25,一般来说如果细胞密度在2-5*10的6次方样子，消化速度非常快。如果细胞密度接近1*10的七次方，消化时间就要加长。不过，你的消化很古怪，为什么要加EDTA呢？直接丢弃细胞培养液，用2毫升PBS洗两次，然后把胰酶加入一亳升，常温放置个一分钟■到3分钟左右，细胞就会消化好了。如果细胞密度大，在温箱放置同样的时间没问题。如果你要判断细胞是否消化好，两个办法，一个是观察细胞贴壁的那层，如果从最开始的透明变成像毛玻璃样，那就是细胞间连接大部分已经

7、打断，摇晃下培养瓶，看培养液中有没有细胞开始脱落，如果有一丁点细胞脱落的话，细胞消化的差不多了。另一个办法就是直接在显微镜下看形态，如果细胞80%以上都变圆。那也就OKTo