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1、植物学通报2002,19(2):234～238ChineseBulletinofBotany技术与方法①RNA原位杂交实用技术②徐云远种康许智宏谭克辉(中国科学院植物研究所北京100093)摘要利用互补RNA为探针进行原位杂交是分析组织或细胞内RNA分布的行之有效的方法,通过对mRNA分布的研究可以了解特定基因的表达情况。原位杂交技术过程较长,操作繁琐,从而在一些实验中不能得到很好的使用,为此本文根据我们过去的实际操作经验对该技术中的一些使用技巧作简要的介绍。关键词原位杂交,基因表达ThePracticalTechniqueofinsituHybridizationwithRNAP
2、robeXUYun-YuanCHONGKangXUZhi-HongTANKe-Hui(InstituteofBotany,TheChineseAcademyofScience,Beijing100093)AbstractInsituhybridizationwithcomplementRNAprobeisaneffectivemethodtodetectthedistributionofRNAintissueorcell,bywhichtheexpressionpatternofgenecanconsequentlyberevealed.Asthecompleteprocessis
3、longerandmorecomplexthanothermolecularhybridization,theapplicationofthismethod,howeverislimitedincommonlaboratories.Inordertomakethistechniquebeusedwidelyinroutineexperiments,thepracticalskillswereintroducedbasedonpastexperience.KeywordsInsituhybridization,Expressionofgene随着越来越多的基因被克隆,探索这些基因的表
4、达模式是研究其功能的重要环节之一。利用Northern杂交可以说明特定基因在不同器官不同时期的表达情况,如果要在显微或亚显微水平对一些基因的时空表达进行研究,Northern杂交就显得无能为力。根据核酸分子杂交的基本原理和免疫组织化学的成熟方法而发展的原位杂交技术(ISH,insituhybridization)(GallandPardue,1969;Johnetal,1969)为我们提供了行之有效的途径。利用RNA作为探针,与组织内的RNA靶序列杂交,这样可以了解组织或细胞内RNA的分布和数量,而且与DNA探针相比,使用RNA探针有其独特的优点:RNA:RNA热稳定,所以杂交反应
5、结束后可以用高严谨条件洗涤降低背景;cRNA:RNA酶稳定,杂交反应结束后可以用RNase进行酶解除去游离的RNA探针,以降低背景;杂交效率高,根据Cox等(1984)的计算,探针浓度在2ng/μl～6ng/μl时,RNA探针的杂交百分比是DNA探针的8①中科院创新工程项目、国家“973”项目(G19990116)、国家自然科学基金项目(30170094)和中国博士后科学基金项目资助。②通讯联系人。Authorforcorrespondence.作者简介:徐云远,男,38岁,副研究员。先后在兰州大学获学士、硕士、博士学位,现为中科院植物所博士后,目前主要从事植物发育的分子生物学研究
6、。收稿日期:2001205221接受日期:2001208210责任编辑:刘晖©1994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net2期徐云远等:RNA原位杂交实用技术235倍。由于这些优点,RNA探针越来越多地被用于基因表达模式研究。图1原位杂交流程示意图Fig.1Flowchartofinsituhybridization©1994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrights
7、reserved.http://www.cnki.net236植物学通报19卷原位杂交技术基本上包括探针标记、组织固定、包埋、切片、粘片、脱蜡、蛋白酶消化、乙酰化、预杂交、杂交、洗片、免疫检测、封片、照相这些步骤。我们曾使用该技术分析小麦春化相关基因的表达模式,这里仅就应用过程中的一些细节和经验作一介绍,供同行参考。1探针的选择为提高探针的专一性,用作转录RNA探针的DNA片段应与靶序列以外的核酸序列无同源性,所以在转录之前就应考虑所选序列的特点。为使杂交时探针能顺利
