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《一种优化的植物组织rna原位杂交技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、遗传HEREDITAS(Beijing)20(3):27～301998·实验技术与方法·①一种优化的植物组织RNA原位杂交技术陈绍荣 毕学知 吕应堂 杨弘远(武汉大学生命科学学院,武汉430072)AOptimizedinSituRNAHybridizationTechniqueinPlantTissuesCHENShaorongBIXuezhiLǔYingtangYANGHongyuan(CollegeofLifeScience,WuhanUniversity,Wuhan430072)RNA-RNA原
2、位杂交技术以其RNA探针的标记效率高、通透性强、结合稳定、杂交信号强等优势,已被广泛应〔1〕用于植物和动物组织的基因时空表达研究。RNA探针的标记物有放射性和非放射性两种类型。以前,人们多采用放射性标记探针。近年来,因非放射性标记探针的安全、稳定、省时和操作方便而被越来越多的研究者所接〔2,3〕受。国内RNA原位杂交技术在动物组织中应用比较广泛,但在植物组织中的应用尚未见报道。我们参考有关〔4～8〕文献,利用地高辛(digoxigenin)标记的钙调素反义RNA探针,检测水稻雌蕊中钙调素mRNA的空间分
3、布和表达水平,获得明显的阳性反应。在实验过程中,我们根据植物组织的特点,对一些操作步骤进行必要的取舍和修改,从而建立了一种优化的植物组织RNA原位杂交技术。1材 料 和 方 法操作过程应尽量避免RNase污染,耐高温器皿180℃烘烤8h以上,其它器皿用氯仿冲洗,溶液用011%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理或DEPC-H2O(DEPC处理过的蒸馏水)配制,DEPC是一种RNase强烈抑制剂。111材料水稻(OryzasativaL.)晚粳931开花前后雌蕊用FAA(10%甲醛、50%乙醇、3%冰乙酸)固定,
4、常规酒精系列脱水与石蜡切片,切片厚度10μm。〔8〕钙调素cDNA由Sasaki等分离,日本NIAR(NationalInstituteofAgrobiologicalResources)和STATF(Insti2tuteoftheSocietyofTechno-InnovationinAgriculture,ForestryandFisheries)水稻基因组研究计划(JapaneseRice+GenomeResearchProgram,RGP)Nagamura博士提供,长度为018kb,克隆在pBl
5、uescriptⅡSK质粒中,克隆位点为〔10〕NotI/SalI,两端分别有T3和T7RNA多聚酶启动子。按常规方法转化、扩增和提取质粒,受体菌株为大肠杆菌TG1。NotI和SalI内切酶、T3和T7RNA多聚酶以及地高辛标记检测试剂等分别购自B.M.公司、Promega公司和Sigma公司。112制片载玻片在洗液中过夜,充分清洗后经180℃烘烤8h以上,在含100μg/ml多聚赖氨酸的10mmol/LTris-HCl(pH810)中室温浸泡30min,室温晾干。切片用DEPC-H2O45℃展片、贴片
6、,40℃烘烤过夜。113质粒DNA线性化①国家自然科学基金资助的项目。28遗 传HEREDITAS(Beijing)199820卷质粒10μg,10×消化缓冲液10μl,无菌水定容到100μl,加SalI或NotI20单位,37℃保温2h以上。消化液用酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次,每次1,1000×g,4℃离心5min,上清液用011倍体积3mol/L乙酸钠(pH512)和2倍体积乙醇沉淀过夜,11000×g,4℃离心20min,70%乙醇洗涤一次,真空干燥。将线性化质粒cDNA按1μg/μl重
7、悬于DEPC-H2O中,-20℃以下保存,并取2μl点样电泳,检测线性化纯度。114地高辛标记的体外转录在冰上按顺序加入线性化质粒DNA1μg,2μlNTP标记混合物,2μl10×转录缓冲液,1μlRNase抑制剂(20单位/μl)。DEPC-H2O定容至18μl,2μlT3或T7RNA多聚酶(20单位/μl),轻轻混匀和离心后,37℃保温2h,加入2μl无RNase的DNaseI后,37℃保温15min,2μl012mol/LEDTA终止反应。加入215μl4mol/LLiCl和75μl冰冷的100%
8、乙醇,过夜沉淀,4℃下12000×g离心15min,用70%冷乙醇清洗,真空干燥,根据沉淀物的多少(6～10μg),重悬于30～50μlDEPC-H2O中,并加入20单位RNase抑制剂,-20℃保存。115预杂交将干燥的石蜡切片在二甲苯中脱蜡30min,在二甲苯∶乙醇(1∶1)、100%、95%、70%、30%乙醇、DEPC-H2O中复水,每级2min,012mol/LHCl中20min,2×SSPE中两次,DEPC-H2O中两次,每次5
