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1、第20卷第2期大连医科大学学报Vol.20,No.21998年6月JournalofDalianMedicalUniversityJun.1998β-榄香烯抗癌作用与诱发肿瘤X细胞凋亡的研究邹丽娟李杰于丽敏邵淑娟杨佩满卢步峰张晨(大连医科大学第二临床学院肿瘤科)(大连医科大学基础医学院组胚教研室)(解放军210医院)摘要β-榄香烯是从中药莪术中提取的抗癌有效成分。试验用MTT方法、Hoechst33342和PI荧光染色法及流式细胞术分析法,检测β-榄香烯乳剂对K562细胞生长的影响。结果提示:β-榄香烯明显抑制K562细胞的生长和诱导细胞凋亡,呈浓度和时间依赖性。对K
2、562细胞的半数生长抑制剂量(IC50)为17114μg/ml。提示β-榄香烯诱导肿瘤细胞凋亡是其抗肿瘤作用的重要机制之一。关键词β-榄香烯;K562细胞株;IC50;凋亡分类号R730.21榄香烯是从中药莪术中提取的抗癌药链霉素100μg/ml,置37℃,5%CO2孵物,是一种以β-榄香烯为主要成分,同箱中培养。时含有少量α及γ-榄香烯及其它萜烯类112药物、试剂及仪器化合物,它的抗癌作用已经证实。β-榄香β-榄香烯乳剂(大连药物化学研究烯(β-elemene)是从莪术中提纯的一种所提供);RPMI-1640(美国GI-BCO2倍半萜衍生物,为新开发的非细胞毒性的B
3、RL公司);小牛血清(大连生物制剂抗癌药物。本实验采用人红白血病细胞株厂);hoechst33342及碘化丙啶(prodidi2K562细胞,研究β-榄香烯乳剂对k562细umiodide,PI)(Sigma公司);MTTLI3胞的杀伤及凋亡的诱导作用,以期为该药-(4,5)-双甲基-乙-唑塞-(2,临床应用开发提供必要的基础研究。5)-二甲基澳化四氮唑蓝](Sigma公司);酶标仪(日本岛津);流式细胞仪1材料与方法(EPICSV,美国Coulter公司);其余试剂111细胞培养均为国产分析纯。人红白血病细胞株K562细胞由本校113MTT法测定β-榄香烯的细胞毒性
4、4基础医学院组胚教研室提供,常规培养于取对数生长期K562细胞(5×10ml)RPMI-1640完全培养液(pH712)内180μl。接种于96孔板内,分别加入不同(含15%小牛血清,青霉素100μg/ml和浓度的β-榄香烯乳剂20μl(对照组加培X国家自然科学基金资助课题10大连医科大学学报第20卷养液20μl),培养72h后,加入浓度为5mg/ml的MTT20μl,继续孵箱中培养4h,弃100μl上清后加入异丙醇100μl,充分吹打,在酶标仪上测定595mm波长的光密度值(OD值)。抑制率=(1-od药/od对)×100%。分别用相应化疗药物浓度作横轴、抑制率做纵
5、轴绘制曲线。在曲线上找出IC50(细胞抑制率达50%时化疗药物浓度),IC50表示化疗药物的细胞毒性。114Hoechst33342与PI染色观察凋亡图2β-榄香烯乳剂对K562细胞作用48小时时细胞形态及计数凋亡、坏死率细胞凋亡的影响5取1×10/mlK562细胞分别置于含给药24h后分别收集上述不同浓度浓度为0、215、510、1010、2010、4010μg/的细胞,离心,经PBS(1×)洗一次,ml的β-榄香烯乳剂和相应浓度的乳剂培加入PI染液30min,4号针头过滤后上养液中培养,分别于不同的时间(24、48、72机检测。h)取上述各细胞将每个浓度的细胞分置
6、于2结果2个1ml离心管中,离心弃上清后,分别加入浓度为8μg/ml的Hoechst33342100211β-榄香烯乳剂对K562细胞的细胞ml,浓度为100μg/ml的PI染液与毒性Hoechst33342800μg/ml共染液50μl,静MTT法测K562细胞的生长抑制结置15min(遮光)后,用PBS(1×)洗2次,果见图1。将沉淀重新悬于PBS(1×)中,滴片,置萤图1结果表明,榄香烯乳剂对K562光镜下观察,染成蓝绿色为凋亡细胞,红色生长有明显抑制作用。且随着剂量的增加为坏死细胞。观察细胞凋亡形态并计数凋而增高,其药物浓度与抑制率呈直线相亡、坏死百分率。关。
7、用直线回归方程统计结果示IC50为115流式细胞仪对细胞凋亡的检测图340μg/ml的β-榄香烯乳剂在不同的作用时间图1β榄香烯对K562细胞生长的抑制作用对K562细胞凋亡的影响第2期邹丽娟等:β-榄香烯抗癌作用与诱发肿瘤细胞凋亡的研究1117114μg/ml。状,核仁消失,出现凋亡小体。动态观212荧光镜下检测β-榄香烯乳剂对察,凋亡细胞呈阶段性改变。而被PI染K562细胞凋亡的影响成红色的坏死细胞,镜下观察比较少见,β-榄香烯乳剂对肿瘤细胞凋亡的影且多在1%～3%,坏死细胞的多少与药响荧光镜观察结果见图2～4。物浓度和作用的时间长短无明显的关系
