固定化酶催化剂在合成非天然氨基酸中的应用.pdf

《固定化酶催化剂在合成非天然氨基酸中的应用.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第42卷第4期化工技术与开发Vo1．42No．42013年4月Technology&DevelopmentofChemicalIndustryApr．2013固定化酶催化剂在合成非天然氨基酸中的应用王波，罗运柏(武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉430072)摘要：非天然氨基酸是重要的精细化工原料和医药中间体。采用酶催化制备非天然氨基酸，具有绿色、安全、收率高、成本低等优点。通过固定化这一技术手段，酶可以回收使用达20次以上。关键词：酶催化；固定化；非天然氨基酸；合成；产业化中图分类号：TQ426．97文献标识码

2、：A文章编号：1671-9905(2013)04-0007-02非天然氨基酸是很重要的一类有机化合物，其规模稍大的固定化也可以采用LentiKat公司生中很多都具有生物活性，常被用作精细化工原料和产的手动挤压试验设备完成。医药中间体。而酶催化作为一种新型的合成方法，1．3合成L．2一氨基丁酸因具有条件温和、作用专一、副产物少等优点，在医Oo药及食品等行业中得到越来越广泛的应用。本文利／＼伽NAD用亮氨酸脱氢酶及能使辅因子再生的乳酸脱氢酶作0催化剂还原Ot一酮酸制备非天然氨基酸。Mo1．Wt．：102．09Mo1．W

3、t．：103．12在500mL带机械搅拌的三口瓶中依次加入80g1实验部分2．酮丁酸，118g甲酸铵(约2．4倍当量)，0．2gNAD1．1试剂与仪器及400mL磷酸盐缓冲液(Na2HPO4／NaH2PO4，0．05M，试剂：2一酮丁酸、三甲基丙酮酸、环丙基酮酸、甲pH8．5)，用浓氨水将溶液pH值调至8．5，再加入4g酸铵、NAD、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，以上试剂均固定化酶，在300(2水浴中搅拌反应，20h后，取样进为化学纯。亮氨酸脱氢酶(LeuDH)和乳酸脱氢酶行HPLC分析，转化率>99％，ee值>99％。

4、(FDH)来自CODEXIS公司。将反应液升温到80—90℃，加入活性炭，过滤后仪器：数显酸度计、高效液相色谱仪、2201型紫减压浓缩至3mL，冷却结晶，过滤，烘干，得到【广2氧外分光光度计、UNITY—PLUS500型核磁共振仪、基丁酸71．2g，收率为88％，纯度>98％，ee值>99％。WRS一1B数字熔点测定仪。1．4合成L椒亮氨酸1．2酶的固定化溶解3．0g聚乙二醇在35mL的H，O中，再加入OHNAD5．Og聚乙烯醇，将温度升至9O～95℃。待聚乙烯醇UU完全溶解后，将温度降至25～30℃，加入4g亮氨

5、酸Mo1．wt．：130．14Mo1．Wt．：131．17脱氢酶粉(LeuDH)和2g乳酸脱氢酶粉(FDH)，与将78g三甲基丙酮酸和57g甲酸铵溶解于上述溶液混匀，时间1h。用一次性吸管吸取混合液，400mL水中，用少量磷酸溶液调节pH=8．5，加入到并注在平面上形成直径约2mm的圆片状，然后移人恒压滴液漏斗，备滴加用。在1L带机械搅拌的四口恒温培养箱30℃干燥1—1．5h，移人Na2SO溶液稳瓶中加人十二水合磷酸氢二钠，用400mL水搅拌溶定2h，滤干并用清水洗涤2次，移人10mM磷酸缓解，再用少量磷酸溶液调节

6、pH=8—5加人6g固定化冲液，待用。酶和0．2gNAD。控温至3O～35℃，边滴加三甲基丙作者简介：王波(1981．)，男，汉族，硕士研究生，工程师，主要从事药物合成化学研究工作，E-mail：wb13007@163．t3om通讯联系人：罗运柏(1956-)，男，汉族，博士生导师，教授，武汉市科技专家委员会委员，从事精细化学品与应用有机化学的教学和科研，E-mail：ybai@whu．edu．en收稿日期：20134)24348化工技术与开发第42卷酮酸和甲酸铵的混合溶液边搅拌反应，lOh滴加完，用乙醇重结晶得到

7、白色固体产物，干燥后得到产物然后继续反应10h，取样进行HPLC分析，转化率>6．9g，收率为71％，纯度>98％，ee值>99％。99％，ee值>99％。2结果分析与讨论将反应液升温到70～75℃，加入活性炭，过滤后本文采用聚乙二醇／聚乙烯醇体系对LeuDH减压浓缩至200mL，冷却结晶，过滤，烘干，得到L．和FDH这两种酶进行固定化，LeuDH对底物进行叔亮氨酸67g，收率为86％，纯度>98％，ee值>转化，而FDH对NAD进行还原再生。通过实验验证，99％。母液过WA一2型阳离子交换树脂，吸附(吸附用本文中

8、的方法进行生产的固定化酶可以重复使用量为60g·IJ．)，脱盐，洗脱回收产品，累计收率达20次以上，酶活丧失少，机械性能稳定。94％。参考文献：1．5合成S．2-氨基环丙基乙酸『1]王波，梁晓亮，王玉全，等．固定化全细胞催化合成非天然氨基酸的方法『P】．CN102352387，2012-02．15．0HNAD【21祝俊，苏金环，曾聪明，等．一种酶法制备L．2