水体总细菌计数.pdf

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1、水体总细菌计数方法：AODC计数最早由Francisco等采用该方法计数自然水体中的细菌总数，从而确定了该方法的基本程序（Franciscoetal.,1973），后经由Hobbie等人（Hobbieetal.,1977）改进形成经典的计数方式而推广。国内目前主要用于水生环境中细菌的计数，有外文文献报道用该法富集硝化细菌的富集（ÅgotAakråetal.,1999），尚未发现将该法用于硝化细菌分离的实验。郑忠辉1992年在《亚硝酸氧化细菌分离方法的比较》一文中提到稀释法成功分离到硝化细菌，参照该实验方法

2、，利用AODC技术方法取代传统的细菌计数进行硝化细菌的分离。本实验主要依据chwinghamer的操作,采用0.22µm的纤维素微孔滤膜拦截细菌，截留率可以达到90%以上（chwinghamer,1988）。实验中将低压真空泵更换成手动的玻璃过滤器，操作更方便。具体实验参数由预实验操作确定，最终确定的操作步骤如下：（1）取样：无菌操作条件下，准确吸取4mL的富集培养液于灭菌烘干的7mL离心管内，盖紧盖子。（2）振荡：将离心管固定在振荡器上，振荡10min,使菌体充分打散。（3）固定：加入40%甲醛0.16

3、0mL，混合均匀，固定1-2min。（4）梯度稀释：9mL无菌水进行10倍数梯度稀释，确定稀释后液体量为9mL。（5）染色：加入1g/L的吖啶橙0.9mL，控制吖啶橙的终浓度约0.01%，染色时间7min。（6）过滤：旋开无菌的一次性过滤器（直径25mm），在过滤器滤层上加盖一片直径25mm，孔径0.45μm的微孔滤膜（保证0.22μm膜的平整性），再在膜上放置一片直径25mm，孔径0.22μm经2g/L苏丹黑4℃浸泡16-24h的微孔滤膜（苏丹黑浸泡以去除微孔滤膜本身的自发荧光），旋紧后，标记，用过滤器

4、吸取染色后液体，微孔过滤，使菌体截留在0.22μm的苏丹黑溶液处理的膜上，蒸馏水3mL洗涤染色液PA瓶，洗涤液依然微孔过滤。（7）镜检观察：干净的载玻片上滴加一滴松柏油，将0.22μm的微孔滤膜转移到玻片上，加盖松柏油，再加盖干净的盖玻片，保证膜与盖玻片间无气泡，100x油镜下找到界面，转换荧光显微镜微调至细菌荧光清晰界面观察，选取荧光点数在30-80的稀释度计数，在该稀释度中选取10个视野，记录荧光点数，一个点代表一个菌。S1v1（8）原菌体浓度E计算：EXVN，其中X表示平均视S2v22野菌

5、数，是10个视野中荧光点数的平均值，S1表示磨面积，等于Dπ/4,其中D2表示膜直径，为25mm，S2表示视野面积,等于dπ/4,其中d为显微镜视野直径，为0.22mm；v1、v2分别表示原菌液（4mL）和固定后菌液体积（4mL+0.160mL）,v1/v2表示过滤的稀释液中原菌液比例；V表示过滤的稀释菌液的体积，为9mL；N表示稀释倍数。实验中所有试剂，蒸馏水均经过0.22μm的微孔过滤，实验所用的过滤器，无菌水，注射器，7mL离心管，枪头等均灭菌后使用。