复氧模型的建立.pdf

《复氧模型的建立.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、132心肺血管病杂志2015年2月第34卷第2期JournalofCardiovascular&PulmonaryDiseases~February2015,Vo1．34,No．2DOI：10．3969／j．issn．1007-5062．2015．02．015基础研究·人真皮微血管内皮细胞的原代培养及低氧／复氧模型的建立鲁昆王月丽王海红关啸王绿娅辛毅褚小玲林煌[摘要]目的：培养人真皮微血管内皮细胞，建立人真皮微咀管内皮细胞低氧／复氧模型。方法：采用酶消化及联合磁珠分选法，得到人真皮微血管内皮细胞(HDMECs)，体外培养传至P5代，采用Ⅷ因子免疫荧光及CD309、CD34流式细胞学进行鉴

2、定。用缺氧Buffer加低氧舱的方法低氧处理P5代HD—MECS。实验分为四组，Con组不做任何处理、H8组低氧8小时组，H8R12组低氧8小时复氧12小时组、H8R24组低氧8小时复氧24小时组。TUNEL(脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法)染色法检测细胞凋亡，蛋白质印迹法(WesternBlot)检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶一3(Caspase一3)蛋白的表达。结果：联合法分离的细胞，经过2次CD31磁珠分选后，可见细胞短梭形，呈铺路石样。细胞传至P5，Ⅷ因子免疫荧光染色阳性率为(95-4-2．61)％。流式细胞仪检测CD309阳性率为(95．4±1．34)％；CD34阳性

3、率为(42．5±3．23)％。TUNEL染色、WesternBlot结果显示：H8组的细胞凋亡率和活化的Caspase一3表达高于Con组(P<0．05)，H8R12组、H8R24组细胞凋亡率和活化的Caspase一3表达高于H8组(P<0．05)。结论：本研究采用磁珠分选的办法成功培养了HDMECs，并且建立了HDMECs低氧／复氧模型，为临床研究游离皮瓣缺血再灌注损伤机制提供实验基础。[关键词]人真皮微血管内皮细胞；低氧／复氧；细胞凋亡[中图分类号】R54[文献标志码】A[文章编号】1007-5062(2015)02-132-05Primaryculturedandestablish

4、mentofhypoxic／reoxygenationmodelofhumandermalmicrovascularendothelialcellsLUKun，WANGYueli，WANGHaihong，GUANXiao，WANGLvya，XINH，CHUXiaolin，LINGHuangUniversityofSouthChina，Hunan421001，China[Abstract]0bjective：Usingenzymaticdigestionandmagneticbeadseparationcombinedmethodtoex—tracttheflapmicrovaseular

5、endothelialcells，createanendothelialcellmodelofhypoia／reoxygenationmodelinvitro．Methods：usingenzymedigestionandcombinedmagneticbeadseparationmethodtogetpeopleflapmi—crovascularendothelialcellsculturespreadtotheP5Invitro，usedimmunofluorescenceandfluidcytologytoi—dentificationit．Adoptthemethodofoxy

6、genBufferwithlowoxygentankprocessingP5HDMECs，Experimentisdividedintofourgroups，Connotdoanyprocessing，H8grouphypoxia8hgroup，H8R12reoxygenation12haf-terhypoxiaof8h，H8R24reoxygenation24hafterhypoxiaof8h．PercentageofapoptosiscellswasdetectedbyTUNELstainingmethod(TdT—mediateddUTPNick—EndLabeling)．Prot

7、einimprintingmethod(WesternBlot)detectionproteinexpressionofCaspase一3．Results：thecombinedmethodtoseparatecells，aftertwoCD31mag—neticheadseparation，andculturedinvitro，cellswerespindleshaped，apavingstone．ToP5，immunofluor