高糖对体外培养人脐静脉内皮细胞中c-fos影响探究.doc

《高糖对体外培养人脐静脉内皮细胞中c-fos影响探究.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、高糖对体外培养人脐静脉内皮细胞中c-fos影响探究【摘要】目的观察高糖作用人脐静脉内皮细胞时C-fos基因mRNA和蛋白的表达的变化。方法提取并体外培养人脐静脉内皮细胞，分别加入不同浓度葡萄糖(5.5mmol/L.11mmol/Lx22mmol/L、44mmol/L)并分别作用不同时间，应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测c-fos基因mRNA的表达,免疫细胞化学检测C-fos蛋白表达。结果经髙糖处理的人脐静脉内皮细胞中,C-fos基因mRNA的转录水平明显高于对照组(P3.2高糖对c-fos基因表达的影响3.2.1总R

2、NA的鉴定总RNA提取产物在紫外分光光度计下测A260/A280的0D比值在1.8~2・0之间。经1.0%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪下可见2条清晰的条带，分别28s、18s,且28s/18s>1.5,示RNA无明显降解。3.2.2c-fos在HUVECs中的转录PCR扩增后的产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后于凝胶图像分析系统摄像,进行灰度分析，结果见下图1、2,c-fos和GAPDH扩增片段分别为150bp和420bp,与理论设计相符。图1不同处理因素对c-fosmRNA转录的影响图222mmol/LGlu作用不同时间

3、c-fosmRNA转录3.2.3葡萄糖浓度对c-fosmRNA转录的影响选取5.5mmol/L、11mmol/L、22mmol/L、44mmol/L浓度组以观察葡萄糖对C-fos基因转录的浓度影响。从图1可以看出，各组GAPDHmRNA水平相差不大，但c-fosmRNA的量从5.5~22mmol/L随葡萄糖浓度增加而逐渐增高(P0.05)o相关灰度比值数据从略。4讨论c-fos属于即刻早基因，正常情况下在大多数细胞都有极低水平的表达，参与细胞的正常生长、增殖、分化、调节细胞内信息传递等生理过程。在受到多种伤害性时，能迅速表达，

4、参与细胞的凋亡、修复等过程。但一般来说，其表达快速、短暂;mRNA半衰期短，不稳定;并且通过亮氨酸拉链结构与Jun蛋白形成异源性二聚体复合物，即具有活性的转录因子复合物AP-1.AP-1通过顺式作用激活相关的基因，从而调节基因的表达与蛋白质的合成［3］。本研究发现高糖(22mmol/L)作用下，HUVECs中c-fos的mRNA水平在1h左右达到高峰，随后下降。随葡萄糖浓度增髙c-fosmRNA表达量也增加，葡萄糖浓度至22mmol/L达最高峰,44mmol/L时下降，其原因可能与葡萄糖浓度过高毒性作用增加抑制细胞活性等有关。

5、c-fos蛋白表达也随时间延长而逐渐增高，至2h达最高峰，随后下降，与其他研究基本一致［4］。甘露醇组c-fosmRNA转录和蛋白表达无明显增高。高糖引起HUVECsc-fos转录和蛋白合成增加的原因未明，目前认为可能与PKC通路激活有关，笔者前期的工作也发现了类似结果。AP-1是PKC的经典核内靶分子。高糖激活PKC通路的机制如下:①从头合成(denovo)途径：高糖经酵解产生中间产物，逐步酰化合成DAG,此为高糖激活PKC的主要途径;②磷脂酶D水解磷脂酰胆碱生成DAG途径;③山梨醇通路激活、蛋白质非酶糖化、氧化应激均可使D

6、AG生成增加而激活PKC［5］。笔者发现高糖时HUVECs中PKC通路激活一方面可以引起VEGF的转录和蛋白质合成增加［6］,因此可能导致血管内皮细胞增生，新生血管形成；另一方面引起c-fos转录和蛋白合成增加，从而导致内皮细胞的凋亡［7］。具体哪方面因素何时占主导地位，可能是一个值得研究的课题。在此，不妨可以大胆假设一下：在糖尿病的早期，以第一条途径为主，此时表现出来的是内皮细胞增生，血管内皮层较为完整；至中晚期,则第二条途径占主导地位，因此出现内皮细胞的凋亡，血管内皮层的破坏，进而出现糖尿病大血管的典型病变。参考文献[1]

7、王立岩，冬晓红，宫桂兰，等•人脐静脉内皮细胞的体外培养、鉴定及形态观察.白求恩医科大学学报,2000,26(1):26-28.[2]ShinichiSakurai,ShahabuddinAlam,GloriveePagan-Mercado,etal.RetinalCapillaryPericyteProliferationandc-fosmRNAInductionbyProstaglandinD2throughthecAMPResponseElement.InvestOphthalmolVisSci,2002,43：2774-

8、2781・[3]LiangF,SeyrantepeV,LandryK,etal.Monocytedifferentiationupregulatestheexpressionofthelysosomalsialidase,neul,andtriggersitstargetin