利用显色法快速筛选大豆脂肪氧化酶缺失突变体-论文.pdf

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1、2012年7月中国粮油学报V0l_27．No．7第27卷第7期JournaloftheChineseCerealsandOilsAssociationJu1．2012利用显色法快速筛选大豆脂肪氧化酶缺失突变体董德坤姜莹傅旭军黄英运袁凤杰朱丹华(浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所，杭州310021)(深圳华大基因研究院，深圳518083)摘要以杭州国家大豆改良分中心保存的野生和栽培大豆资源为研究材料，利用显色法对大豆脂肪氧化酶自然缺失突变体进行筛选。从348份种质中发现同时缺失大豆脂肪氧化酶Loxl和L0)【2的野生大豆种质1份ZYD0451l，同

2、时缺失大豆脂肪氧化酶Lo)【2和Lox3野生大豆种质1份ZYD04452，以及缺失大豆脂肪氧化酶Lox2或其含量极低的栽培大豆种质5份：ZDD06271、ZDD06044、ZDD13834、ZDD06245和VP35。试验结果同时表明显色法是一种简便快速的大豆脂肪氧化酶缺失突变体筛选方法。关键词大豆脂肪氧化酶突变体显色法中图分类号：$565．1文献标识码：A文章编号：1003—0174(2012)07—0l10—05大豆脂肪氧化酶(Lipoxygenas，EC1．13．11．12，缺失种质用于优良品种的选育将是一种十分有效的简称Lox)是一类含非血红

3、素铁、不含硫的蛋白质，分解决豆腥味问题的途径。子质量为94～97ku。在成熟大豆种子中约占总蛋本试验采用显色法对杭州国家大豆改良分中心白的1％～2％。它能催化具有顺，顺一1，4一戊二烯保存的野生和栽培大豆种质进行分析筛选，以期获结构的多元不饱和脂肪酸的加氧反应，如亚油酸、亚得大豆脂肪氧化酶缺失的优良种质。麻酸等生成具有共轭双键的脂肪酸氢过氧化物，如乙醛和茉莉酮酸脂等，这些挥发性物质导致大豆及l材料与方法其制品产生豆腥味¨-3]。Theorell等和Christopher1．1试验材料等先后分离纯化了大豆脂肪氧化酶的3种同功酶从浙江省农业科学院杭州国家

4、大豆改良分中心Lox一1、Lox2和Lox3(Lox3a、Lox3b)。在形成豆制品保存的野生和栽培大豆资源中随机选取348份种质挥发性气味物质和豆腥味物质中，Lox2起主要作用，用于脂肪氧化酶缺失突变体的筛选。Loxl和Lox3作用相对较小-s]。Lox2缺失时豆腥大豆脂肪氧化酶缺失对照分别为：脂肪氧化酶味明显降低，Lox2和Ix~x3同时缺失几乎没有豆腥全缺失品种大青豆(缺Loxl，2，3)记为kO；x2和味，当Lox全缺失时根本不产生豆腥昧，并且LoxLox3缺失品种‘五星一号’记为L1；Lox2缺失品种的缺失对大豆的性状并无显著影响。‘五星二

5、号’记为L13。其中‘五星一号’和‘五星二大豆加工过程中消除大豆脂肪氧化酶的主要手号’由河北省农业科学院张孟臣研究员惠赠。段包括高温加热处理、微波处理、有机溶剂萃取和水1．2试剂与溶液配制解酶处理等。但是在处理的过程中大豆蛋白质品亚油酸、吐温、次甲基蓝、二硫苏糖醇(DTI')、硼质会受到影响，其溶解度、黏性等特性降低或丧失；砂、硼酸磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、Tween20：上海生其他营养成分如维生素等也会受到破坏；同时加工工生物工程技术有限公司；B一胡萝卜素：Sigma—的过程还增加了能量的消耗和生产成本的投入。而Aldrich公司；其他试剂均为分析纯

6、。研究表明，使用Lox缺失大豆制作的豆制品不仅豆腥SLS(亚油酸钠底物)溶液：分别称取70．0mg亚味低，而且具有较高的蛋白质水平、VE含量和清除油酸钠和70．0mgTween20，将其溶于4．0mL水中，DPPH自由基的活性_l。因而筛选大豆脂肪氧化酶混合均匀后加0．55mL0．5mol／L的氢氧化钠溶液基金项目：浙江省公益性项目(2011C22058)直到澄清，加蒸馏水定容至25．0mL，抽真空处理，而收稿13期：2011—10一O8后进行分装，液氮冷冻后置一80℃冰箱保存备用。作者简介：董德坤，男，1978年出生，博士，大豆分子育种通讯作者：朱

7、丹华，男，1957年出生，研究员，大豆遗传育种p—cs(B一胡萝卜素底物)溶液：称取10．0mg第27卷第7期董德坤等利用显色法快速筛选大豆脂肪氧化酶缺失突变体111B一胡萝卜素，加入10．0mL丙酮，充分溶解后滤纸放入分光光度计中，记录A452变化，检测时间5过滤，再加入与滤液等量的丙酮将其稀释成50％饱min；以上检测均记录每隔10s的动态变化数据。和溶液，棕色瓶4℃保存。1．6数据统计分别配制0．2mol／LpH=9．0的硼酸钠缓冲液、分光光度计法记录的动态变化数据利用Origin—0．2mol／LpH=6．0的磷酸钠缓冲液和0．2mol／LP

8、ro7．5软件进行绘图。pH=6．6的磷酸钠缓冲液备用。Loxl检测溶液：分别取25．0mL0．2mol／L