慢病毒法建立稳定表达HPV-16 E6癌蛋白的肺癌细胞株-论文.pdf

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1、第32卷第2期广东医学院学报、bl_32NO．22014年4月JOURNALoFGUANGD0NGMEDICALCOLLEGEApr．2014129慢病毒法建立稳定表达HPV-16E6癌蛋白的肺癌细胞株冯芸，丰晓威，刘锦华，刘飞，李祥勇，兰柳波，陈小谊，唐旭东(广东医学院生物化学与分子生物学研究所，广东湛江524023)摘要：目的探讨慢病毒法建立人乳头瘤病毒(HPV)．16E6癌蛋白表达肺癌细胞株的可行性。方法采用重组DNA技术将HPV-16E6基因插入到含有增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒质粒载体(PLIG)中，获得重组

2、慢病毒载体(PLIG—E6)，经双酶切和测序鉴定正确后，与慢病毒包装载体一起转染293T细胞，收集病毒液，测定滴度后，感染NCI．H460~J$癌细胞株。经G418筛选培养4周后，提取细胞基因组DNA和蛋白，分别用PCR和Westernblotting方法分析NCI—H460细胞中HPV-16E6DNA和蛋白的表达。结果双酶切及测序结果表明重组慢病毒表达载体构建成功；感染慢病毒液的NCI．H460细胞中可检测出HPV-16E6DNA和蛋白表达。结论用慢病毒法成功构建稳定高表达HPV-16E6癌蛋白的肺癌细胞株。关键词：H

3、PV-16E6；慢病毒方法；肺癌；质粒中图分类号：Q78；R73文献标识码：A文章编号：1005．4057(2014)02—0129—05D0I：10．3969~．issn．1005·4057．2014．02．001EstablishmentoflungcancercelllineswithstableHPV-16E6expressionusinglentiviralmethodFENGYun，FENGXiao—wei，LIUJin-hua，LIUFei，LANLiu—bo，CHENXiao—yi，TANGXu-dong

4、(InstituteofBiochemistryandMolecularBiology,GuangdongMedicalCollege，Zhanjiang524023，China)Abstract：ObjectiveTostudythefeasibilityoftheconstructionoflungcancercelllineswithhumanpapillomavirus(HPV)-16E6expressionusinglentiviralmethod．MethodsUsingDNArecombinanttechn

5、ique，therecombinantvectorPILG—E6wasacquiredbyinsertionofHPV-16E6geneintolentiviraltransferplasmidPLIGcontainingenhancedgreenfluorescentprotein．AfteridentifiedbydoubledigestionandDNAsequencing．therecombinantplasmidwaspackagedwithpackagingvectorsandtransfectedwith2

6、93Tcells．The1ungcancereel11ineNCI-H460wastransfectedwithrecombinantvectorPILG．E6afterlentivirustiterwasdetermined．ThetransfectedcellswereculturedwimG418mediafor4weeks．followedbydetectionofHPV-16E6DNAandproteinusingPCRandWesternblotting．respectively．ResultsDoubled

7、igestionandDNAsequencingrevealedthesuccessfulconstructionoftherecombinantlentiviralexpressionvector．HPV-16E6DNAandproteinwereexpressedinlentivirus—infectedNCI—H460cells．ConclusionLungcancercelllinewimstableoverexpressionofHPV-16E6oncoproteincanbesuccessfullyconst

8、ructedbylentiviralmethod．Keywords：HPV-16E6；lentiviralmethod；1ungcancer：plasmid人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是E6癌蛋白对肺癌细胞生物学功能的影响及其机制提一种双链无包膜DNA病毒，大量临床样本分析和体供更稳