生物技术原理与方法(基因工程).ppt

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1、生物技术原理与方法浙江大学生物技术研究所胡东维主要讲课内容一、概论(3学时)二、基因工程(9学时)三、细胞工程(3学时)四、发酵工程(1学时)五、酶工程(2学时)一、基因工程原理与方法基因克隆的基本原理基因工程的工具－－酶基因工程载体基因文库转基因技术转基因策略一、基因的结构与表达调控真核生物与原核生物基因的结构一、基因的结构与表达调控真核生物与原核生物基因的结构原核生物结构基因的组成多数以操纵子形式存在，多个基因转录；但往往分别翻译。无内含子结构。一、基因工程原理应用实例1。利用Bt基因防治棉铃虫Bt是苏云金杆菌的晶体蛋白，具有高度特异性杀虫活性。在昆虫消化道内降解成为活化毒

2、性肽，导致昆虫死亡。该基因无内含子结构；但与真核生物的编码嗜好不同。一、基因工程原理应用实例1。利用大麦抗病基因(Mla)提高植物抗病性Mla是大麦的叶绿体蛋白，可增强对白粉病菌抗病性。Mlo的DNA约3700bp，具有11个内含子。cDNA是可利用的方式基因工程的基本原理基因工程的基本原理二、基因工程工具酶和DNA加工基因工程的关键技术包括DNA的合成、切割、修饰加工、连接等。DNA在连接之前必须进行加工，把DNA分子切割成所需的片段。有时为了便于DNA片段之间的连接，还须对片段末端进行修饰。一般把DNA分子切割、DNA片段末端修饰和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。二、基因

3、工程工具酶和DNA加工基因工程的关键技术包括DNA的合成、切割、修饰加工、连接等。DNA在连接之前必须进行加工，把DNA分子切割成所需的片段。有时为了便于DNA片段之间的连接，还须对片段末端进行修饰。一般把DNA分子切割、DNA片段末端修饰和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。二、基因工程工具酶和DNA加工1.DNA切割1.1限制性内切酶(restrictionendonuclease)类型：即I、II/III型酶。真正有用的是II型酶。命名：属命＋种名＋菌株＋顺序号HindIII；EcoRI；BamHI。至今已发现上千种限制性内切酶，常用的有几十种。特异性：4－6碱基的识别位点

4、HpaII：C’CGGEcoRI：G’AATTCBamHI：G’GATCCAhaIII：TTT’AAA二、基因工程工具酶和DNA加工1.DNA切割1.2DNaseDNaseI无识别的内切酶，可产生大小均一的片段。1.3物理方法利用超声波；振荡、加压等。二、基因工程工具酶和DNA加工2.DNA的修饰Phosphatase去除DNA末端的5’P，防止分子间的连接。Polymerase补平DNA双链；合成DNA和RNA分子。Exonucleases补平DNA双链Methylase保护内切酶位点的降解二、基因工程工具酶和DNA加工3.DNA的连接类型平端连接与粘端连接。酶T4DNAlig

5、ase：平端连接与粘端连接E.coliDNAligase：粘端连接三、简单的基因克隆策略克隆已知基因或其同源基因片段DNA的提取PCR方法扩增特异性片段插入载体上转化细菌筛选重组子三、简单的基因克隆策略mRNA提取cDNA的合成PCR扩增特异性片段转化细菌筛选重组子四、基因文库基因组文库：Genomiclibrary包含所有基因组DNA片段重组子的总和。多用于基因结构研究。cDNA文库：cDNAlibrary(Expressionlibrary)包含所有cDNA分子的重组子的总和。多用于基因表达产物，即基因功能的研究。四、基因文库基因组文库的构建：基因组DNA的提取基因组DNA的

6、消解(随机)补平插入载体(连接)扩增载体类型：l噬菌体：23kb粘粒：37－52kbBAC(细菌人工染色体)：350kbYAC(酵母人工染色体)：>1mb四、基因文库2.cDNA文库的构建：总mRNA的提取反转录cDNA合成插入l噬菌体载体(连接)转化进入细菌扩增载体类型：lZAP噬菌体：23kb四、基因文库基因组文库的筛选基因组文库培养DNA探针或蛋白抗体探针筛选挑单斑测序鉴定五、PCR原理与方法一般30－40个循环。单分子的理论扩增可达109。六、常用载体的种类与结构质粒载体Plasmidori：复制起点Ampr、Tetr：抗性筛选基因适宜的克隆位点适当的拷贝数六、常用载体

7、的种类与结构质粒载体Plasmid六、常用载体的种类与结构质粒载体Plasmid六、常用载体的种类与结构2.噬菌体载体phagevector六、常用载体的种类与结构2.噬菌体载体phagevector六、常用载体的种类与结构3.粘粒载体cosmid（重组子37－52kb）六、常用载体的种类与结构4.酵母人工染色体yeastartificialchromosomse(YAC)CEN4，4号染色体的着丝粒TEL，端粒ARS，自主复制起点TRP1和URA3，酵母选择标记SUP4，蓝白