基因工程原理与技术课件.ppt

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1、第十一章动物基因工程动物基因工程转基因育种分子辅助育种生物反应器基因治疗第一节动物目的基因的选择与表达载体的构建一、动物转基因操作的一般程序(见下图)①目的基因的分离与克隆；②表达载体的构建；③受体细胞的获得；④转基因的导入与转基因胚胎的获得；⑤受体动物的选择与转基因胚胎的移植；⑥转基因整合表达的检测与转基因动物的获得；⑦转基因动物的选育或转基因表达产物的分离纯化。二、目的基因的选择①编码或调控机体生长发育或特殊形态表征的基因；例如：生长激素基因、人生长激素释放因子基因②增强抗病作用的基因及免疫调控因子基因；例如：人类促衰变因子基因、鸡马立克氏病毒基因③药用蛋白基因。例

2、如：组织纤溶酶原激活剂基因、乳铁蛋白基因转基因的结构特征对其表达有较大的影响：基因组DNA>微小基因>cDNA三、表达载体构建1、基于普通质粒的表达载体①构建元件a、调控基因转录的元件增强子内含子激素应答元件启动子组成型启动子组织细胞特异性启动子生长发育特异性启动子诱导特异性启动子b、促进染色体变构和开放的元件位点控制区：位于基因5’端，DNaseI的高敏区核基质黏附区c、翻译调控元件②用于基因打靶的表达载体构建基因打靶是指利用同源重组将目的基因整合到受体细胞染色体的特定位点上。包括：插入型打靶载体(一个位点同源重组，导致整个载体的插入)、取代型打靶载体(两个位点同源重

3、组,导致外源基因取代靶基因序列)a、基因敲除是指通过基因打靶而使特定的靶基因失活的技术。负选择标记b、hitandrun法敲除靶序列，引入突变基因。c、双置换法(两步打靶法)敲除靶序列，引入突变基因。d、基因敲入基因敲入是指通过基因打靶将外源基因置于靶基因调控序列下游而受到调控的技术。同源重组2、基于病毒的表达载体构建3、基于YAC的表达载体构建用于超大基因的表达。如210kb人乳清蛋白基因四、外源基因的组织特异性表达组织特异性基因的启动子及其上游调控区。乳腺生物反应器乳蛋白基因启动子及其激素应答元件乳汁中含有人生长激素的转基因牛第二节动物基因转移的方法一、DEAE-葡

4、聚糖法二、脂质体介导法三、磷酸钙沉淀法四、血影细胞介导法五、精子介导法(精子载体法)六、病毒转染法七、显微注射法(微注射法)八、胚胎干细胞介导法九、同源重组法(基因打靶法)第三节转基因动物的鉴定一、DNA水平的检测1、Southernblotting2、PCR检测法3、Dotblotting4、FISH法二、RNA水平的检测1、Northernblotting2、RT-PCR法三、蛋白质水平的检测1、ELISA法2、Westernblotting3、SDS-PAGE法4、目的蛋白活性检测法第四节提高转基因动物外源基因表达的策略一、动物转基因技术存在的问题1、成本高、成功

5、率低2.5万美元/转基因猪，50万美元/转基因牛2、转基因效率低显微注射法：0.38%3、转基因的遗传率低G0×G0→G1中30%阳性率(理论值75%)4、转基因动物疾病模型与预期不符5、转基因动物产品的安全性二、提高转基因动物外源基因表达的策略1、采取适当的导入方法和整合方式逆转录病毒转染法的整合频率最高，但其克隆容量有限，而且获得的转基因动物常是嵌合体。同源重组的整合频率不高，但在预定位点整合。显微注射法的整合频率也不高。2、利用位点独立性元件核基质黏附区、基因座控制区3、选择合适的目的基因与表达载体4、通过共转化(多个外源基因)5、利用基于YAC的表达载体6、利用

6、基因打靶技术第五节动物基因工程技术的应用一、转基因动物育种1、动物超高产及品质育种转基因超级小白鼠转基因牛：生长快(牛生长激素基因)、无乳糖牛奶(乳糖酶基因)转基因猪：生长素基因转基因鱼：生长素基因，1985年中国获得第一例转基因鱼。2、动物抗病育种抗病基因动物抗病基因：组织相容性复合体基因、淋巴激活素基因病原体的结构蛋白基因：病毒外壳蛋白基因针对病原体RNA的基因：反义RNA基因、核酶基因细胞因子及其受体基因：白细胞介素II基因、干扰素基因病原体的单克隆抗体基因转基因牛：干扰素基因转基因兔：单克隆抗体基因转基因猪：单克隆抗体基因转基因鸡：禽类白血病病毒外壳蛋白基因二、

7、供人体器官移植的转基因动物抑制排斥反应的基因：DAF(decayacceleratingfactor)基因、RCA(regulatorofcomplementactivation)基因、MCP(membrane–cofactorprotein)基因1992年英国剑桥大学White培育出转hDAF基因猪；Yannoutsos等获得转hDAF微小基因-MCP基因猪；Duke大学研究人员获得转DAF-CD59基因猪，并把转基因猪的心脏移植给狒狒，比对照的存活时间长得多。三、转基因动物生物反应器根据外源基因的表达部位可分为：动物乳腺生物反应器、动