小花棘豆（Oxytropis glabra）内生真菌固体培养条件优化研究-论文.pdf

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1、第4l卷第1期内蒙古师范大学学报(自然科学汉文版)Vo1．41No．12012年1月JournaloflnnerMongoliaNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Jan．2012小花棘豆(Oxytropisglabra)内生真菌固体培养条件优化研究何珊，卢萍，包睿媛(内蒙古师范大学生命科学与技术学院．内蒙古呼和浩特010022)摘要：从采自内蒙古鄂尔多斯市的小花棘豆中分离得到内生真菌．研究菌株OW5．3的优化固体培养条件．在不同碳源、初始pH条件下，检测内生真菌的生长速度J并利用气相色谱技术测定内生真菌茵丝体中

2、苦马豆素的含量．结果显示：菌株OW5．3最适起始pH为7．0；以葡萄糖为碳源时生长速度较快；以燕麦片为碳源时，菌丝体的苦马豆素含量最高．关键词：小花棘豆；内生真菌；优化培养；苦马豆素中图分类号：Q948．122．3文献标志码：A文章编号：1001-8735(2012)01-0105-04小花棘豆(Oxytropisglabra)，俗称醉马草、绊肠草、马绊肠等，是豆科(Leguminosae)棘豆属(Oxytropis)多年生草本植物，生长于草原、荒漠草原及荒漠区的低湿地上，耐寒、耐贫瘠，为轻度耐盐碱中生植物[1]．该植物许多植株内含有对牲畜有毒的生物碱—

3、—苦马豆素(swainsonine，SW)t，牲畜采食并在体内积累到一定程度后会引起中毒，表现为食欲不振、精神抑郁、体重下降、母畜流产，重者甚至死亡[5]．因此小花棘豆蔓延会给畜牧业造成巨大的经济损失．Dennis等[8于1986年对SW进行研究，发现其具有抑制肿瘤细胞生长的重要作用，因而SW的开发利用逐渐受到重视．鉴于人工合成SW步骤复杂、产量低、成本高，因而生物提取成为获得SW的重要途径．近年来，国内外学者已从甘肃棘豆[9]、小花棘豆[及茎直黄芪[】等疯草中成功分离得到产SW的内生真菌[1．卢萍[1。。、霍鸿雁从不同地理种群的小花棘豆中分离培养得到内

4、生真菌，并鉴定该真菌属于Embellisia．但目前关于不同培养条件对棘豆内生真菌SW含量影响的报道很少，本文选择文献[10]中产SW的菌株OW5．3，通过改变固体培养基的培养条件，对内生真菌进行优化培养研究，旨在为今后用内生真菌生产高含量SW奠定基础．1研究材料与方法1．1材料材料采自内蒙古鄂尔多斯市乌审旗，生境为低湿地．1．2方法1．2．1小花棘豆内生真菌的培养选择60℃烘干的单株小花棘豆植物的茎，切段作为外植体，在超净工作台上，将长约1cm左右的外植体用7O乙醇浸泡30S、20次氯酸钠溶液浸泡3rain，用无菌双蒸水清洗2次，每次约30S，然后置于

5、灭菌滤纸上吸干，接种到1．5水琼脂培养基上，于25℃下培养．待茎切段外植体周围长出适量真菌菌丝体后，用接种环刮取菌丝体，转至PDA培养基上，划线分离得到单菌落(至少划线3次以上)，将之转接到PDA培养基上继续培养．1．2．2培养基的制备以马铃薯蔗糖琼脂培养基(potatodextroseagar，PDA)作为基础培养基．制备基础培养基：称取200g去皮马铃薯，切成1em见方小块，放于1ooomL烧杯中，加水1000mL后煮沸20min，用纱布过滤除去马铃薯残渣，加人20g蔗糖和18g琼脂粉，搅拌溶解，用双蒸水补足至收稿日期：201卜07—07基金项目：国

6、家自然科学基金资助项目(30860049)作者简介：何珊(1986一)，女，内蒙古包头市人。内蒙古师范大学硕士研究生通信作者：卢萍(1964一)，女(蒙古族)，内蒙古海拉尔市人，内蒙古师范大学教授，博士，主要从事遗传与分子生物学、分子生态学研究，E—mail；luping@imnu．edu．cri．内蒙古师范大学学报(自然科学汉文版)第41卷l000mL，分装于两个锥形瓶中，高压灭菌后备用．制备不同碳源培养基：将基础培养基中的蔗糖分别用等量的3种碳源(葡萄糖、燕麦片、玉米粉)代替，配备不同碳源的培养基．制备不同初始pH培养基：将基础培养基分装在4个锥形瓶

7、中，用1mol／L的盐酸和氢氧化钠分别将初始pH调至6．0、6．5、7．0、7．5后，灭菌备用．1．2．3接种将生长在PDA培养基上的菌株OW5．3用打孔器切成数个圆饼状菌饼，分别置于不同培养基上培养，每皿放1个菌饼，每种培养基做3个重复．1．2．4培养条件对菌落生长速度及SW含量的影响选择不同碳源培养基接种内生真菌，每种碳源培养基做3个重复，于25℃下恒温培养45d后，测量菌落大小，提取SW，并测定其含量．菌落大小的测量：将两条坐标纸沿菌饼直径位置交叉固定在每个培养皿的背面，从培养第4d开始，每隔3d以菌落边缘4个菌丝体生长点为基点测量菌落直径，每个菌

8、落测2次，共测3个菌落，计算其平均值．SW标准曲线的绘制：称取SW标准品，用吡啶