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《骨髓间充质干细胞的转染.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、第一大肠杆菌感受态的制备转化是将外源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段。受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能容许外源DNA分子进入的感受态细胞。一，实验材料：1，LB液体培养基：称取蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g,溶于800ml去离子水中，用NaOH调节PH到7.5，加去离子水定容至1L,高压灭菌20min.2，LB平板培养基：LB液体培养基中按1.5%的浓度加入琼脂，加热溶解，进行高压灭菌。取出后趁热在无菌条件下，倒入无菌的平皿中，每套平皿中加入12-15ml，凝固后倒置，
2、4℃冰箱保存备用。3，0.1mol/lCaCL2溶液：称取1.1g五水CaCL2用双蒸水溶解，定容到100ml.高压灭菌20min.二，实验步骤：1，从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单个菌落，接种到3-5mlLB液体培养基中，37℃震荡培养12h左右，直至对数生长期，然后将该菌液以1：100(1：50)接种到100mlLB液体培养基中，37℃震荡培养2-3h至OD600nm=0.52，培养液在冰上冷却10min,转入离心管中，4℃下，4000r/min离心10min.3,弃去上清液，用预冷的0.1mol/lCaCL2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30m
3、in.4,4℃下，4000r/min离心10min.5,弃去上清液，加入300μl预冷的0.1mol/lCaCL2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即制成感受态细胞悬液。6，以上制备好的细胞悬液可在冰上放置，24h内用于转化实验，或添加冷冻保护剂（15-20%）后超低温-70℃冷冻贮存。第二，将带有目的基因的载体质粒转化到感受态大肠杆菌中。1，取200μl感受态细胞悬液（若是冷冻保存液，冰浴中使其解冻，解冻后立即进行下面操作）加入载体质粒溶液（含量不超过50ng,体积不超过2μl）.2，将含有混合液的离心管轻轻摇匀，冰上放置30min后，42℃水浴中热
4、冲击2min,然后迅速置于冰上冷却3-5min.3，向各管中加入100μlLB液体培养基，使总体积约为0.2ml,即制备成转化反应原液，混匀后37℃温浴15min以上，震荡培养。此时细菌回复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。第三，质粒菌落的准备1，LB培养基的配制：称取胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g.加入适量去离子水摇动容器至容器溶解，然后用5M(mol/l)氢氧化钠调节ph到7.0，然后用去离子水定容到1L,待上述溶液完全溶解后，向另一广口瓶中加入琼脂粉，每100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉。进行高压灭菌后，将融化的LB固体培养基
5、在55℃水浴中，待培养基温度将至55℃即授课触摸，加入抗生素，每100mlLB培养基中加入1ml100mg/ml的卡那霉素（1g/1000ml），充分摇匀。2，LB培养板制作：将加入抗生素的LB培养基充分摇匀后倒入90x25mm2皿中10-20mlLB,倒板后打开盖子半盖状态，在紫外灯下10-15min.最后封口，4℃保存。3，划板接种菌：用接种环取新鲜培养的菌落或甘油菌液，划板接种到卡那霉素（千分之一）的LB平板上，37℃温箱孵育16-18h(一般12h开始生长菌落，时间以菌落生长状态判断。)，将平板应该反放，注意不可让菌落长太大。4，摇菌：（1）首先
6、将卡那霉素2ml,解冻，然后加于200ml高压灭菌后的LB液体培养基中，摇匀，然后用5ml移液枪分装两个10ml离心管，每管5ml含卡那霉素的LB培养基。然后立即对LB液体培养基的容量瓶封口，并酒精擦拭火焰消毒。在使用5ml移液器过程中，枪头不可碰到容量瓶或离心管壁。（2）其次，用10微升或0.5-1微升的抢吸取培养板上的单个菌落，然后将枪头在10ml离心管中晃动数次，将枪头打入10ml离心管中。（3）最后，对10ml离心管封口，用记号笔记下操作时间，操作质粒菌的名称，顺序。（如：2011，8，17a/bs3）（4）将接种取完的菌板封闭放于4℃，将含有卡
7、那霉素的LB培养基放于4℃，将10ml离心管管口封闭好，用报纸包扎放于塑料泡沫中，放入摇床，37摄氏度，200r,摇16-18h(目的是使细菌快速生长，并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。)2，储备甘油菌：制备10-15%甘油菌液，将高压灭菌好的甘油放于4℃保存，然后将摇过的菌取出，将甘油与菌液一同放入无菌操作台中，在灭菌条件下，用剪刀剪1ml枪头一个小斜口，然后吸取400微升甘油放于3ml菌液中，然后进行涡旋震荡，待甘油菌液混匀后，将甘油菌液封口，记下标记放于-20℃保存。注意事项：1，卡那霉素使用时，首先应分装到ep管中以100mg/ml,每管3ml
8、浓度放入5ml管中，-20℃保存。第二，质粒DNA分子的大量提取1，准备材料：已
