骨髓间充质干细胞的研究进展.doc

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1、骨髓间充质干细胞的研究进展【关键词】骨髓干细胞骨组织工程学研究内容主要包括三方面a)种子细胞的研究；b)支架材料的研究；c)组织工程化骨的临床应用。其中种子细胞是组织工程研究中首要的、最基本的环节。作为骨组织工程的理想种子细胞，应具有以下特点：a)结构比较简单，是不具有特定机能的原始细胞；b)取材容易，对机体损伤小；c)体外培养增殖能力强；d)可在一定条件下向特定方向转化；e)稳定表达成骨细胞表型；f)植入人体后能继续产生成骨活性；g)无致瘤性［1～2］。20世纪70年代中期已证实骨髓间充质干细胞(Bonemesenchymalstem，BMSCs)具有自我增殖能力和分化潜

2、能，且具有来源广泛、取材简单、分化成骨的潜能强等特点，成为目前骨组织工程种子细胞研究的重点。　　1BMSCs体外增殖的生物学特性及培养　　1.1BMSCs的体外增殖生物学特性　　干细胞是指那些具有高度增殖和自我更新能力，并能分化为两种以上不同类型组织细胞的细胞；组织干细胞是指发育成熟的个体内具有多向分化潜能的细胞，目前比较明确的能够转化的组织干细胞主要是BMSCs。对BMSCs的细胞周期研究表明，其大约有20％为静止期细胞，即G0期细胞。这表明BMSCs具有强大的增殖能力，每传一代细胞数量就增加2～4倍。但有文献报道，高度传代(大于25代)的BMSCs中有一部分已经表现出凋

3、亡特性。　　1.2BMSCs的体外培养　　Freidenstein发现了骨髓培养中有呈纺锤状的少量贴壁细胞，能够分化形成多种中胚层组织，包括：骨、软骨、肌腱、肌肉组织、骨髓基质结缔组织等，这种形成集落的初始骨髓基质细胞被称为成纤维细胞样细胞集落形成单位(Colonyformingunitfirbroblastic，CFUF)。Minguell［3］认为BMSCs为存在于骨髓基质中的非造血来源的细胞亚群，Ashton称其为骨髓基质成纤维细胞。BMSCs对营养条件要求高，而且含量很低，约为0.001％～0.01％，要利用BMSCs就必须实现其体外分离培养及扩增［4］。　　

4、BMSCs培养方法主要有全骨髓培养法和离心培养法。前者是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清(浓度为10％～20％)，塑料培养瓶较一般玻璃培养瓶更有利于BMSCs贴壁生长。细胞融合后以1∶2比例传代，3～4d换液一次［5］。离心培养法是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释，以1500～2000r/min离心20～306min，采集交界处的单核细胞层，缓冲液洗涤2～3次后，加入培养液接种培养。BMSCs接种密度的大小

5、直接影响BMSCs的增殖能力。低密度接种(5000/cm2)BMSCs无论在扩增速度还是扩增倍数上都明显高于高密度接种。机体内BMMSC数量很少，接种数目太少会影响成骨率，太多对于临床应用又不太现实。段小军等在实验中研究发现，种植密度较高时严重影响BMSCs的贴壁生长，考虑为含有的红细胞、白细胞比重大于BMSCs而首先沉积于瓶底，且细胞代谢废物增多所致。研究表明每立方厘米载体接种1×106个细胞就能满足成骨要求。　　低氧张力条件下培养BMSCs，其细胞增殖速度大大提高，且细胞碱性磷酸酶表达也大大增强［6］。考虑其原因是机体内氧分压明显低于外界(140mmHg)，特别是骨髓内

6、氧分压只为30～50mmHg，大约相当于外界的1/3。因此BMSCs长期暴露于高氧分压条件下，必将导致细胞过度氧化，功能下降。如果体外进行培养的条件与体内氧分压相似，则更利于细胞功能的保留。　　顾祖超等［7］人在实验中发现，兔BMSCs原代培养，其开始贴壁(1～2d)的时间和完全贴壁时间(12～24d)均长于传代培养的BMSCs，传代的BMSCs不形成集落，形态更加单一，呈梭形，14d内没有形成明显的钙结节。BMSCs经诱导后的形态主要为多角形，其贴壁率有所下降，且在12～14d内形成明显钙结节。传代细胞与诱导细胞两者的生长曲线无统计学差异，倍增时间为33.6～34.6h，

7、生长高峰均在接种后6～7d出现。BMSCs长满单层后，可出现多层生长，没有发生接触抑制。BMSCs其成骨活性随着供体年龄增长呈下降趋势，年龄越大在培养中形成的群落和具有成骨样细胞特点的细胞越少，而细胞对诱导因子的敏感性下降。目前，三维细胞培养技术已在骨组织工程中得到广泛应用，Kinoshita等［8］利用胶原凝胶载体培养BMSCs，发现三维的胶原网络能有效的刺激成骨细胞分化；Glowacki等［9］采用培养液灌注造成动力性三维细胞培养环境，增加了细胞的适应生存能力及成骨功能。三维细胞培养能够有效地种植功能细胞、保持