同步荧光法测定大鼠血浆中牛血清白蛋白的研究

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1、第28卷第5期影像科学与光化学Vo1．28No．52010年9月1agingScienceandPhotochemistSept．，2010同步荧光法测定大鼠血浆中牛血清白蛋白的研究覃光炯。，高云华(1．中国科学院理化技术研究所光化学转换与功能材料重点实验室，北京100190；2．中国科学院研究生院，北京100049)摘要：以异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白为模型药物，采用同步荧光法测定了大鼠尾静脉注射模型药物后血浆中药物浓度随时间的变化．系统研究了样品处理、测试条件等一系列因素对测试结果的影响，建立了一种简单有效的测定生物体内的微量外源性蛋白质的方法，并与酶联免疫吸附法测

2、定结果进行了比较，二者的测试结果具有良好的一致性．关键词：同步荧光法；牛血清白蛋白；血药浓度；酶联免疫吸附法文章编号：1674—0475(2010)05—0354—08中图分类号：0657文献标识码：A许多蛋白质和多肽类物质在临床上具有药效_1]，可用来治疗某些特定的疾病．随着生物学技术的飞速发展，越来越多的蛋白质和多肽类药物已被广泛的研究，有的已进入临床实验阶段Ⅲ2]．测定这类药物在给药后的药代动力学参数，特别是血药浓度一时间曲线，对于判定药物的疗效、确定最优给药剂量、指导临床用药具有重要意义．蛋白和多肽类药物的药代动力学具有生物半衰期短、血药浓度低等特性，同时生物体内有

3、大量相似的干扰物质存在，使蛋白和多肽类药物的药代动力学测定更加困难．目前常用的分析方法主要为免疫分析法[4]、同位素标记示踪法[5]、生物检定法[6]以及一些理化分析技术如高效液相色谱、质谱、色质联用[7]等．但这些方法都有一些缺陷，如免疫分析法需要开发相应的抗体，测定时间较长，测定结果在很大程度上受到药物与对应抗体的反应性的影响；同位素标记法测定需要特定的防护措施；高效液相色谱、质谱测定，样品前处理步骤复杂，且测试所用仪器均较昂贵．在药物的前期研究中，大多采用动物实验的方法评价药物的药代动力学Es，．本论文收稿日期：2010—05—11：修回日期：2010—05—25．通

4、讯联系人：高云华，E-mail：yhgao@mail．ipc．ac．el作者简介：覃光炯(1983一)，博士研究生，主要从事药学分析研究，E-mail：gjqin@yahoo．con3．cn．354第5期覃光炯等：同步荧光法测定大鼠血浆中牛血清白蛋白的研究355拟建立一种快速、灵敏的测定实验动物体内蛋白和多肽类药物血药浓度的分析方法．采用异硫氰酸标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)为模型药物，通过对样品处理、测试方法等一系列条件的摸索，建立了一种采用同步荧光法测定FITC-BSA的大鼠体内药代动力学的分析方法，并用酶联免疫吸附法(ELISA)验证了该方法的准确性．1实验部

5、分1．1仪器与试剂仪器：F-2500荧光分光光度计(日本Hitachi公司)；RT-2100C酶标仪(深圳市蕾杜电子有限公司)；EASYPureLF超纯水仪(美国Barnsted公司)；TGL_16B高速离心机(上海安亭科学仪器厂)．试剂：异硫氰酸荧光素标记牛血清白蛋白(FITC-BSA，标记比MF丌c：MBsA一1．75，pfjSA一15．12mg／mL，北京成文免疫化学研究室)；牛血清白蛋白酶联免疫试剂盒(无锡罗益生物技术有限公司)；牛血清白蛋白标准品(中国药品生物制品检定所)；氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均为分析纯试剂，所有实验所用水均为超纯水．1．2大鼠血

6、液的采集以及血清血浆的制备雄性SD大鼠(250g)乙醚麻醉之后，采用5．0mL注射器心脏取血．血清制备：血液取出后装入2．0mL离心管中，4℃保存，于6h之内离心，取上清液得到血清．血浆制备：血液样品取出后装入肝素钠抗凝的离心管中，并立即离心，得到血浆．离心出的血清和血浆样品如不立即使用，于一2O℃冷冻保存。1．3不同浓度FITC-BSA的血清、血浆、缓冲溶液荧光测试配制pH一7．4的磷酸盐缓冲液(PBS)方法：取0．2gKC1，0．2gKHPO4，8．0gNaC1，0．29gNa2HP04·12H2O于1L烧杯中，加入950mL超纯水溶解后，调节pH至7．4，然后定容至1

7、．0L．依次用大鼠血清、血浆和PBS缓冲液将FITC-BSA溶液分别稀释至0．1、0．5、1．5、3．0、5．0、10．0／~g／mL．设定F-2500荧光仪的激发波长为480nm，测定扫描波长范围5O0—7O0nm的荧光发射光谱．1．4普通激发测试与同步荧光测试对比同步荧光扫描技术与常用的荧光测定方法最大的区别是同时扫描激发和发射两个单色器波长．由测得的荧光强度信号与对应的激发波长(或发射波长)构成光谱图，称为同步荧光光谱．恒波长同步荧光法是在扫描过程中使激发波长和发射波长彼此间保持固定的波长间隔，一般设定该波长