应用实时荧光定量pcr测定牛体细胞端粒长度

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1、·154·遗传繁育中冈畜牧兽医2010年第37卷第9期应用实时荧光定量PCR测定牛体细胞端粒长度吕昆，林丹，许淼，朱怡文，黄英(上海交通大学医学院，上海市儿童医院上海医学遗传研究所，卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室，上海市生殖与胚胎T程重点实验室，上海200040)摘要：本研究为了验证应用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitativePCR，QPCR)测定牛基闵组端粒长度的可行性，选取18个不同来源牛耳成纤维细胞抽提基组DNA为样本，对QPCR和经典的Southern印迹法进行了相关性分析。结果显示，QPCR测定端粒长度相对T／S为1．16±0．24，Sout

2、hern印迹法测量端粒平均TRF值为16．99kb±0．85kb，两种方法获得的结果相关性分析R。一0．5612(P

3、zlein等，2005)。几乎所有的真核细胞都有端粒存较高，但其需要大量的DNA样品(0．5～5g)，试在，不同真核细胞的端粒有着类似的DNA序列和验周期长(3～5d)，成本高，而且所测TRF还包括结构。端粒高度保守，一般由极其简单的串联重复部分亚端粒区，选取不同限制性内切酶，所得TRF序列组成。研究结果发现，端粒长度与衰老和疾病值可能不同。因此，该方法不适于大量样品端粒长有着密切的关系(Btasco等，2005)。哺乳动物体细度的测定。随着对端粒相关领域研究的深入，如何胞克隆经过十几年的发展，已取得了很大进展，体细方便、快速、高通量地处理大量样本的问题显得尤为胞核

4、移植作为一种有效的无性生殖手段，在基础研突出。2002年，Cawthon提出应用荧光定量PCR究、组织再生和拯救濒危动物方面有着巨大的应用的方法测量端粒长度，并被广泛应用于人白细胞基潜力，因此越来越多的受到人们的关注。然而由于因组DNA长度的测定。实时荧光定量聚合酶链反种种原因，体细胞核移植生产的动物常会出现各种应(quantitativePCR)作为测量端粒长度的新方法，出生缺陷。由于端粒长度与再生、衰老和疾病(如肿与经典的Southern印迹法相比，具有方便、快捷、成瘤)密切相关，在畜牧业(牛、羊、猪)中要进行优良品本低、一次可测定多个样本等优点；该方法测定端粒

5、种的克隆繁育，克隆濒临灭绝珍稀动物的供核细胞(t)重复拷贝数与单拷贝基因(s)的比率，即T／S比往往是用成年甚至老年动物的体细胞，所以，科学家率(T／Sratio)，由于T／S比率同端粒长度成正比关对于克隆动物的端粒在胚胎早期如何被修复及端粒系，因此可以通过T／S比率得到端粒的相对长度。长度是否会恢复到正常产生了极大的兴趣。本试验中改进了Cawthon等(2002)的试验条件，选Southern印迹法是进行基因组DNA特定序列取新的内参基因一牛转铁蛋白基因(bovinetrans—定位的通用方法，也是测定端粒长度的经典方法，被ferrin，BTF)，用于牛基因组端粒

6、长度的测定，为畜牧兽医领域中端粒的相关研究提供参考。收稿Et期：201003221材料与方法作者简介：吕昆(1984一)，男，湖北人．硕士生，研究方向：遗传1．1材料学。1．1．1试验动物从上海医学遗传研究所松江大通信作者：黄英(1952～)，女，研究员，硕士生导师。Email：huangying723@smmail．cn动物实验农场随机选取不同年龄荷斯坦奶牛，剪取基金项目：罔家“863”重点项目：人药用蛋白动物乳腺生物反应牛耳组织。器(2007AA100502)；“转基因生物新品种培育”国家1．1．2主要试剂及仪器胎牛血清(FBS)和科技重大专项：应用转基因体细胞

7、克隆技术培育高乳DMEM培养液购自美国Thermo公司；胰酶和青链蛋白(人转铁蛋白)的良种奶牛(2009ZX08007～霉素(P／S)购lq美国Invitrogen公司；SYBRPremixO03B)；L海市科委产学研项目：应用体细胞克隆技术扩繁良种奶牛种群(08DZ2200600)。ExTaq(2×)购自日本TaKaRa公司；Agarose购自中国畜牧兽医2O10年第37卷第9期遗传繁育·155·美国FMC公司；尼龙膜购自美国Amersham公司；3．75ng，稀释因子为2，反应结束后Fh6个稀释度限制性内切酶HinfI和RsaI购自英国NEB公的标准品可得到