实时荧光定量pcr技术

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1、简述实时荧光定量PCR技术1.实时荧光定量PCR技术的原理所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术结合了实时定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件,构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。实时PCR的设想是由Higuchi于1992年最早提出[1]。荧光探针技术是根据标记基团的荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)原理而实现的。当某个荧光基团的发

2、射光谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠,且2个基团距离足够近时,能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长(低能量)的荧光基团,相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽,这个过程称为FRET。定量原理:实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团,使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系,从而得出产物的扩增曲线。理想的扩增曲线应为J型,符合2N方程(其中N为PCR的循环次数),但实际上扩增曲线为S型。在PCR反应早期,不能将产生荧光的水平与背景明显区别,之后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在指数期的某一点上检测PCR产物

3、的量,并由此推断起始模板含量[2-3]。实时荧光定量PCR的标准扩增曲线如图1。其中Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;△Rn的值表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量。基线(baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。图1实时荧光定量PCR的标准扩增曲线荧光阈值(threshold)是以PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(b

4、aseline),荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号标准差的10倍,即:Threshold=10SD(cycle3-15),一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号,可以用于定义一个样本的Ct值。Ct值也称阈值循环(thresholdcycle),指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。研究结果表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准样品可作出标

5、准曲线,因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。简单地说,实时荧光定量PCR的基本原理就是样本核酸扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物结合发光,其荧光量与扩增产物量成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。2.实时荧光定量PCR技术的类型及特点实时荧光定量PCR技术的常用机制包括荧光染料检测和水解探针检测。2.1SYBRGreenI检测SYBRGreenI是一种能结合到dsDNA小沟部位的具

6、有绿色激发波长的染料,它只有与dsDNA结合后才会发出荧光。在变性时,DNA双链分开,不产生荧光;在复性和延伸时,形成dsDNA,SYBRGreenI发出荧光。荧光强度逐渐增强,直到达到阈值,被荧光探测系统检测到[4]。因此,荧光强度可以代表扩增产物的数量。SYBRGreenI的优点在于:①成本较低,不需合成和标记探针;②适合初步筛查:选用SYBR筛查,再用探针法精确定量少数关键样品。但其缺点有:①特异性差,不能分辨主带与杂带,给出的是总信号,所以在低样本浓度时,不能进行基因突变分析。但该方法可利用熔点曲线分析将特异产物、引物二聚体和非特异

7、性产物区别开来,不需要通过电泳鉴定;②不能做多重检测,每孔只能检测1个目标基因;③灵敏度低,适合于5000拷贝以上的基因定量。2.2TaqMan探针PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。图2

8、常规TaqMan探针检测原理常规TaqMan探针的5’端标记荧光发射基团FAM(6-羧基荧光素),3’端标记荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)。该探针在PCR过程中不

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