细胞培养基的选择.doc

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1、细胞培养基本技术2第一部分：细胞培养用液及培养基☆培养用液——水平衡盐溶液消化液☆培养基一一天然培养基合成培养基第二部分内容：原代细胞分离、培养（酶消化法和组织块培养法）。细胞生长状况的观察。培养细胞一代生长过程。传代。冻存与复苏。细胞培养注意事项（如细胞污染）。细胞培养的一些专业术语介绍（如细胞株、系，上皮细胞型、成纤维细胞型）第一部分：动物细胞用液的制备平衡盐溶液细胞培养基本技术细胞培养用液及培养基☆培养用液消化液☆培养基——天然培养基合成培养基配液前准备：①滤器、滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒、注射器。贮液瓶（生理盐水瓶）、瓶塞?5磅，121°C,20

2、分钟蒸气灭菌②NaHCO3、NaOH、HC1、胎牛（小牛）血清、青霉素、链霉索、三蒸水、培养基粉剂配液过滤无菌操作要求：操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转1()分钟操作时，小心取用无菌Z实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口。在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行一、细胞培养用液及培养液水•（一）水营养物、代谢物溶丁•水中调节渗透压、平衡pH值普通自来水含大量杂质，不利于细胞生长高度纯化水——离子交换水：蒸憎水：超纯净水：三蒸、新鲜离子交换水：离子交换水中仍有一些非

3、离子物质及有机物，一般在细胞培养中较少使用。双蒸水、三蒸水：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水超纯净水：釆用进口的RO膜、离子交换膜、离子交换树脂、抛光核子级树脂、静音高压泵、电磁阀等，产品性能得到最大化的保证；分子生物学、生命科学、基因研究、组织培养、试管婴儿、生物工程、动物细胞培养、培养基制备、DNA测序、氨基酸分析、疾控中心、水质检测中心、药检所、质检所、高校科研等标准实验室及各种高端精密仪器用水。(二)、平衡盐液体(Balancedsaltsolution,BSS):组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、

4、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分如:PBS、Hanks用途：用于洗涤组织、细胞或配制消化液时等平衡盐液体：组成无机盐、葡萄糖种类：氯化钠浓度、离子浓度、缓冲系统不同Earle——NaHCO3含量高、缓冲能力高，5%CO2平衡Hanks——NaHCO3含量低、缓冲能力低，空气平衡D-Hanks不含钙、镁离了Dulbecco含少量钙、镁离子PBS——磷酸缓冲系统PBS(Phosphate-BufferedSallines)KC1KH2PO4NaClNa2HPO牛7H2O0.20g0.20g8.00g2.16gDPBS(Dulbecco'sPhosph

5、ate-BufferedSallines)标准型CaC12(anhyd.)(无水氯化钙)KC1KH2PO4MgC12-6H2ONaClNa2HPO4-7H2O0」0g0.20g0.20g0.10g8.00g2.16gD-Hanks'平衡盐溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)KC1KH2PO4NaClNaCO3Na2HPO4D-GlucosePhenolRed0.40g0.06gS.OOg0.35g0.048g1.00g0.()lg(三)、消化液——分散组织、细胞——作用：(1)在进行原代培养过程中需分散组织、细胞。(2)

6、在传代中要使细胞脱离附着的底物时均需使用消化液。类型：组织细胞培养中常用的消化液为胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二钠(EDTA)及胶原酶溶液，可以分别单独使用或混合使用。J］夷蛋白酶液(Trypsin)•使细胞间的蛋白质水解、细胞分散培养细胞传代。分离组织、细胞团消化所需时间和浓度与细胞特性相关特点：1、胰蛋门酶的活力用解离酪蛋白的能力来表示，常用的有1：125和1：250两种。2、许多学者认为钙、镁离子和血清的存在都会降低胰蛋白酶的活力。消化细胞时，加入一些血清(10%)或含血清的培养液，能终止消化作用。J］夷蛋白酶溶液配制：称取除蛋口酶粉末置烧杯中，用少VlDHan

7、ks平衡盐（或PBS）溶液调成糊状，再补足D-Hanks平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡次日，过滤除菌，分装入瓶中，・20°C保存备用（以免分解失效）,常用浓度为0.25%（0」%-0.5%）。如果短期内要使用，就放置4°C冰箱。EDTA4Na溶液：一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为0.02%o注意:使用EDTA处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长(E-cadherin)EDTA溶液配制：用D-Hank＜平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4°C冰箱

8、保存联合使用：除蛋白酶和