一种银杏叶片DNA快速提取方法.pdf

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1、第5期总第239期农业科技与装备NO．5TOtalNO．2392014年5月AgriculturalScience&TechnologyandEquipmentMay2014一种银杏叶片DNA快速提取方法姜力耘，邵屹，王战男，郭铁丰，王博(1．辽宁省经济林研究所，辽宁大连116031；2．国有黑山县机械林场，辽宁锦州121400)摘要：在CTAB法的基础上．建立适于银杏叶片DNA微量快速提取的新方法。经紫外分光光度和琼脂糖凝胶电泳检测，该方法提取的DNA在质量和产量上都可满足后续扩增反应的要求。与

2、常规CTAB方法相比，该方法操作简单、速度快、时间短。关键词：DNA提取；银杏叶片；RAPD；PCR中图分类号：$664．3文献标识码：A文章编号：1674—1161(2014)05—0017—02DNA提取是植物分子标记选择中最重要、最基min，弃上清液，70％乙醇漂洗2次残渣后，用灭菌滤本的操作。目前分离高质量植物基因组DNA主要有纸吸干管壁残余乙醇，室温晾干，加入适量TE缓冲CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)法和SDS(十二烷基液及适量Rnase，4oC过夜。硫酸钠)法。但这两种方法存在操作步

3、骤多、程序复2)改良CTAB法：使用玻璃研磨棒在灭菌的1．5杂、周期长等缺点。虽然前人对这两种方法进行了不mL离心管内直接研磨叶片，加入800L预冷的少改进，但木本植物DNA提取仍离不开液氮、人工研CTABfree提取液(200mmol／LTris—HC1，80mmol／L磨、用一巯基乙醇抽提等步骤，检测时间长且毒害较EDTA，0．25mol／LNaC1，2％PVP)，激烈震荡后冰浴l0大，满足不了现代分子生物学快速、高效的要求。为min，3000r／rain离心5rain，弃上清液，立即加入预此

4、．以银杏幼嫩叶片为材料。结合以组织研磨棒液氮热的CTAB改良裂解液(100mmol／LTris—HC1．50研磨为主要步骤的基因组DNA快速提取方法。探讨mmol／LEDTA，O．7mol／LNaC1．1．5％CTAB，2％PVP)．将提取的DNA应用于RAPD分子标记的可行性。其余步骤与常规CTAB法相同。1材料与方法1．2．2DNA质量及含量测定用琼脂糖凝胶电泳法检测1．1材料处理DNA质量，琼脂糖浓度为0．7％，电泳条件为80V、3O2013年4月采集新鲜无病的银杏叶片。用蒸馏min；稀释2

5、0倍后，用紫外分光光度计测量其水清洗叶片后，保存在一20的条件下。260，280nm的OD值，并计算ODOD280，将其最终1．2试验方法质量浓度调至20ng／L。1．2-1DNA提取1．2．3PCR扩增及检测RAPD扩增在MJMini基因扩1)常规CTAB法：取0．1g叶片，加入适量液氮增仪上进行。PCR体系为20L：模板DNA40ng，10研磨4次，移至1．5mL离心管中，加人650L热碱基随机引物0．5~mol／L；2~Taqmastermix。反应混CTAB常规裂解液、650L1．5％CT

6、AB提取液(100合物用20L矿物油覆盖。mmol／LTris—HCl，50mmol／LEDTA，0．7mol／LNaC1，扩增程序为：94℃预变性5rain，94oC变性60S．1．5％CTAB，2％B一巯基乙醇)，于65℃水浴加热6036℃退火60S，72oC延伸90S。共4O个循环，最后于min(每隔10min上下颠倒浮板1次)：10000r／min72℃延伸10rain。扩增产物用1．5％琼脂糖凝胶电泳离心10min，取上清液，加入等体积氯仿异戊醇，混检测，电压条件为80V，2h。在WD一

7、9403D紫外仪系匀成乳浊状，室温放置10rain；10000r／min离心l0统中拍照，记录并观察结果。所用引物为OPI—O1min，移上层水相至新的Effonder管，重复抽提1次；(ACCTGGACAC)，0PI一02(GGAGGAGAGG)．0PI—O3取上层水相，加入2／3体积于一20℃预冷的异丙醇，颠(CAGAAGCCCA)，0PI一04(CCGCCTAGTC)．OPI一05倒混匀后于4℃静置30min：12000r／min离心1O(TGTTCCACGG)。2结果与分析收稿日期：201

8、4—03—052．1DNA纯度和电泳检测结果作者简介：姜力耘(1984一)，男，工程师，从事经济林方面的研改良和传统方法提取的DNA的OD260，OD瑚都介究。