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1、106江苏农业科学2008年第3期高毒力杀蝗绿僵菌的紫外线诱变选育121111程辉彩,敦冬梅,张丽萍,张根伟,董超,崔冠慧(1.河北省生物研究所,河北石家庄050081;2.石家庄职业技术学院,河北石家庄050081)摘要:以金龟子绿僵菌M105复壮菌株M1053为出发菌株,通过紫外线诱变选育,获得Pr1酶活是出发菌株1.36倍的诱变株M105-52。经测定,诱变株的遗传性能稳定,紫外线抗性和杀蝗毒力均有显著提高。关键词:杀蝗绿僵菌;紫外线;诱变选育中图分类号:S4332文献标志码:A文章编号:1002-1302(2008)03-0106-02蝗灾危害范
2、围广泛,与水灾、旱灾并称为严重威酪蛋白10g、琼脂20g、去离子水1000m、lpH值胁我国农牧业生产、影响人民生活的三大自然灾害。6.0,去掉琼脂即为液体培养基。长期以来,我国防治蝗灾仍然以化学农药为主,如有1.2试验方法机磷类、菊酯类及其复配制剂等,化学农药在蝗灾的1.2.1出发菌株虫体复壮用出发菌株孢子感染控制中发挥了重要作用,但同时也给环境安全带来蝗虫,(251)!保湿培养,长出绿僵菌并产生孢子了较大隐患。绿僵菌(Metarhizium)是一种有效的蝗时,用PDA培养基分离、纯化,4!冰箱保存。虫生防制剂,为蝗虫体内寄生病原真菌,对蝗蝻和成1.2.2诱变处理诱变程序:复
3、壮斜面菌种∀菌种虫均有效。作为专用性生物杀虫剂,绿僵菌对昆虫活化∀孢子悬液∀诱变处理∀培养∀初筛∀复筛∀天敌无害,无二次中毒,不污染环境,可持续有效控传代实验∀抗性检测。[1-6]制蝗虫种群在经济受害水平以下。紫外线诱变1.2.2.1菌悬液的制备取一定量绿僵菌孢子放是一种使用时间长、效果好、设备简单、所需费用少、入限量培养液中,28!、200r/min摇床振荡培养12突变随机性强、可在短时间内获得大量突变体的常用h,孢子处于萌发状态时,血球计数板计数并调整孢3诱变选育方法。本试验以研究室保存的M105菌株子浓度为(3~5)#10个/m。l虫体复壮后进行紫外线诱变,以选育高毒力杀蝗绿僵
4、1.2.2.2紫外线诱变及初筛取0.1ml孢子悬液菌菌株,为制备田间具有高防效菌剂奠定基础。均匀涂布于PDA平板上,30W紫外灯下,距离30cm照射一定时间,于(251)!恒温培养箱中避光1材料与方法培养,每个处理3次重复。选取透明圈直径与菌落1.1试验材料直径比值大(D/d)的菌株30~50株进行复筛。1.1.1菌种金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopli1.2.2.3复筛根据初筛结果,从平皿中挑取单菌ae)M105,为本研究室保存。落,接入PGY培养液,28!摇床振荡培养48h,再1.1.2供试昆虫3龄东亚飞蝗蝗蝻,购自河北转入诱导培养液28!摇床振
5、荡培养24h,培养液沧州。10000r/min离心15min,保留上清液进行Pr1酶活测定。酶活定义:用专一性底物Suc-Ala-Ala-1.1.3培养基斜面培养基:PDA培养基;液体培Pro-Phe-pNA测定,以pH值8.0、28!使反应混养基:PGY培养基;限量培养基:葡萄糖5g,去离子合物OD410nm每分钟平均增加0.001的酶量为1个水500ml、pH值自然;诱导培养基:蛋白胨5g、Mg酶活单位,以10l酶液所含的酶活力数表示酶的SO40.5g、KCl0.5g、K2HPO40.5g、FeSO40.01g、[7-8]总活性。1.2.3稳定性研究将诱变筛选出的菌株连续
6、8收稿日期:2007-10-08基金项目:河北省科技攻关项目(编号:05820121D)。次转接,继代培养后,将8代菌种活化接入液体摇瓶作者简介:程辉彩(1974),女,河北栾城人,硕士,助理研究员,主培养,测定Pr1酶活力,观测稳定性。要从事微生物农药研究。Te:l(0311)83014879;E-mai:lhuicai1.2.4紫外线抗性比较把M1053和诱变筛选出cheng@163.com。的菌株孢子悬液分别涂布在PDA平板上,然后置于程辉彩等:高毒力杀蝗绿僵菌的紫外线诱变选育107[9]30W紫外灯下照射,测定孢子存活率。考剂量,因此试验选取60s为诱变处理时间。1.2
7、.5室内毒力测定绿僵菌孢子粉用无菌0.1%2.2.2菌株紫外线诱变选育本试验通过测透明7Tween-80溶液稀释成浓度为1#10sp/g的菌液,圈和菌落直径比值(D/d值)大小的方法进行初筛,微量移液器将2l菌液分别点滴至供试蝗虫的前通过测定Pr1酶活的方法进行复筛。试验结果见表胸背板下方,每个处理20头试虫,3次重复,无菌1,每次选取30~50株D/d值较大的绿僵菌菌株进0.1%Tween-80溶液作对照。放入培养箱中饲
