曲牙土天牛高毒力绿僵菌菌株筛选

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1、曲牙土天牛高毒力绿僵菌菌株筛选［摘要］目的：明确昆虫病原真菌绿僵菌对化橘红害虫曲牙土天牛幼虫的毒力，筛选高致病力菌株，为曲牙土天牛的生物防治提供依据。方法：先利用从化橘红基地土壤中分离及其他实验室提供的36株绿僵菌，制成胞子浓度为1X108个/g的胞子土，对曲牙土天牛1龄幼虫进行初步的毒力测定；在此基础上选取7株分离自化橘红基地土壤的绿僵菌作进一步筛选；并通过液固双相发酵法对筛选出的高毒力菌株的产胞能力进行初步评价。结果：用于作初步毒力测定的36株绿僵菌中，有28株能够侵染曲牙土天牛幼虫，其中6株僵虫率达100%,8株达80%,8株达60%,2株达40%,4株达20%；用于作进一步毒力筛选的

2、7株菌中，有6株表现出较高的毒力，最高僵虫率均大于74%；对这6株菌的产胞量进行测定，产胞量均大于10亿个/g,其中1,4株菌产胞量显著高于其他菌株，分别为2.35±0,25（1X109个胞子/g），2.21±0.27（1X109个胞子/g）。结论：1号和4号菌株对曲牙土天牛1龄幼虫表现出了较高的毒力，并有最强的产胞能力，因此最具开发潜力。［关键词］化橘红；曲牙土天牛；绿僵菌；毒力测定虫害防治是目前中药材生产中最薄弱的环节之一，是实施中药材GAP的重点和难点，在绿色中药材的生产中要防止农药对药材的污染，由于目前市场上缺乏有效的、可替代传统化学农药的新型杀虫剂，使得绿色药材生产理念难以贯彻实施

3、，因此开发有效的生物杀虫剂成为亟待解决的问题。绿僵菌Metarhizium是一类通过昆虫体表进行侵染的虫生病原真菌，能够侵染200多种昆虫以及硬脾等其他节肢动物[1],目前已经大规模成功应用于防治非洲以及澳大利亚的蝗虫[2],是一类具有很大开发价值的生物杀虫剂。化橘红为芸香科植物化州柚Citrusgrandis'Tomentosa'或柚C.grandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，具有镇咳祛痰的功效，是我国的传统道地药材[3]。近年来化橘红根部受到一种地下害虫曲牙土天牛Dorystheneshydropiucspascoes的严重危害，给化橘红生产带来严重损失[4],

4、由于曲牙土天牛幼虫生活在地下，防治难度大，常规的化学农药很难奏效。作者先前在基地调查时发现，土天牛幼虫有被虫生菌感染的现象，并已从化橘红基地土壤中分离到一批绿僵菌[5],据此，本研究选择36株绿僵菌对化橘红害虫曲牙土天牛1龄幼虫进行毒力测定，以期筛选出对其具有高毒力的菌株，为利用绿僵菌防治曲牙土天牛奠定基础。1材料1.1绿僵菌菌株共计36株，其中17株由本实验室分离自广东化州化橘红基地土壤中，2株来自重庆市中药研究院，9株来自中国农业科学院植物保护研究所农业部生物防治重点实验室，8株来自安徽省微生物防治重点实验室，其中菌株mf05为黄绿绿僵菌Metarhiziumflavoviride,mt

5、05为戴氏绿僵菌M.tail,其余菌株均为金龟子绿僵菌M.anisopliae01.2SDY液体培养基1L培养液含酵母浸膏10g,蛋白月东10g,葡萄糖40go1.3大米培养基200g大米装入体积8cmX9cmX34cm、一端开口的聚丙烯食用菌菌种袋里，加60mL水，混匀，静置0.5h使大米充分吸水后，拧拢袋口，120匸高压蒸汽灭菌0.5ho1.4曲牙土天牛幼虫2011年5月底6月初，在广东化州市平定镇天堂嶂的药材基地，夜间利用灯光诱捕曲牙土天牛成虫，配对繁殖饲养获得。1.5仪器北京发恩科贸有限公司D-1型自动蒸汽灭菌锅；太仓市实验设备厂TH2-D台式恒温振荡器；湖北黄石恒丰医疗器械有限公司

6、MJ-01型霉菌培养箱；LeicaDM2000显微镜与LeicaDFC425C显微数码相机组合的成像系统。2方法2.1绿僵菌分生胞子制备向长满绿僵菌胞子的试管斜面中注入2mL0.5%的灭菌聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温-80）溶液，利用接种钩刮动胞子块使其从培养基上脱离并分散开，摇动斜面使胞子充分悬浮。将砲子悬浮液倒入含40mLSDY培养液的三角瓶中，25°C,140r・minl,摇瓶培养72h。将培养好的菌液倒入含有大米培养基的菌种袋里，拌匀使菌液均匀分布到大米基质中，将菌种袋平放，撑开袋体，使大米培养基能充分与空气接触，拧拢菌种袋口避免外界杂菌进入，同时留一定缝隙以供气体交换，将菌种袋

7、置于25°C恒温培养箱中、自然光照培养约2周，当绿僵菌开始大量产砲时，完全打开发酵袋口以便袋内水分排出，继续培养一周完成发酵。利用胞子收集器从发酵物料里面收集纯胞粉，纯胞粉在变色硅胶干燥器中室温干燥1周，4°C保存备用。称量一定质量的砲子粉用0.5%吐温-80水溶液悬浮，利用血球计数板计数、计算出每克纯胞粉的胞子含量。2.2高毒力菌株的初步筛选绿僵菌胞子粉在进行毒力测定前先进行胞子萌发实验，保证用于测试的胞子