精原干细胞中Pten基因敲除小鼠模型的建立及初步的表型分析-论文.pdf

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1、Feb．2014．34(1)实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicinedoi：10．3969／j．issn．1674-5817．2014．01．001·论著·精原干细胞中Pten基因敲除小鼠模型的建立及初步的表型分析周炜，张迪，于卓，查巍巍z，冯立新-(1．上海交通大学医学院，上海200025；2．中国林业科学研究院，北京100091)[摘要】目的建立稳定的精原干细胞中Pten基因敲除的小鼠模型，对表型进行初步观察，为研究Pten在精原干细胞中的作用及相关的机制

2、奠定基础。方法采用Cre／Loxp系统建立Pten在精原干细胞中条件性敲除的小鼠模型，以同窝正常雄鼠作为对照，通过解剖、HE染色等方法对小鼠的表型进行观察，并通过免疫荧光检测精原千细胞标记分子早幼粒细胞白血病锌指蛋白(Plzf)~表达并对免疫荧光染色中的阳性细胞进行统计。结果与对照组相比，Pten敲除鼠在出生后出现发育迟缓现象，13d左右个体死亡，睾丸大小未受影响，但进一步的细胞计数统计发现Pten敲除后Plzf阳性细胞数目和对照组相比明显减少(：0．01)。结论成功建立精原干细胞中Pten基因敲除的小鼠模型，并

3、且Pten可能通过下调PlzfaO表达影响精原干细胞的发育，这为进一步探讨精原干细胞复杂的调控网络提供了一定的实验依据和思路。[关键词]Cre／loxp系统；Pten基因敲除；精原干细胞；表型分析；锌指蛋白(Plz0[中图分类号]Q95—33【文献标识码]A[文章编号]1674—5817(2014)01—0001—05在雄性小鼠中，精原干细胞的存在是精子能表明Pten是维持成体干细胞静止状态和活跃状态平终生生成的前提，所以精原干细胞是否能稳定维持衡的关键因子。Pten敲除的造血干细胞系统中，干与精子形成和不育有密

4、切关系。同时由于精原干细细胞群出现短时间的扩增，伴随的是长期的衰竭，胞能够保持终生高度的活跃性，使之成为研究成体Pten缺失的造血干细胞在受体中重建血液系统能力干细胞十分有利的模型。Asingle型的精原干细胞严重不足，说明Pten是确保造血干细胞长期存在在早期通过有丝分裂进行增殖形成各种不同类型的的关键因子[6]。类似的现象也在神经系统[7，s】等其它细胞亚群以满足大量生精需求，同时亚群问保持相组织中出现。对稳定以维持自我更新和分化的平衡，在正常的生为了研究Pten是否参与精原干细胞的平衡调理状态下很难去理解这

5、么复杂的动态调控。控，本研究采用精原干细胞特异的标记分子Thy1Pten(Phosphataseandtensinhomolog)是一类广(Thymuscellantigen1)启动子驱动的Cre】与谱表达的抑癌基因【1，2】，主要通过抑制PI3K—AKT信Pten—Loxp鼠杂交后自交或回交的方式建立Pten在号通路对下游产生影响，并进一步调节胚胎发育、精原干细胞中特异敲除的小鼠病理模型，作为研究细胞粘附、迁移【，】和凋亡等活动【，。近期的研究精原干细胞复杂调控机制的平台。1材料与方法[收稿日期】2013．08

6、．02、[基金项目】国家自然科学基金(31171409)1．1实验动物[作者简介】周炜(1987．)，男，硕士研究生，Thyl启动子驱动的Cre鼠购自Jackson实验室E-mail：zhouwei5275@grnail．com[通讯作者]冯立新(1966．)，男，教授，博士生导师，专业方向：男(编号：JAX一006143)，Loxp—Pten-Loxp小鼠受赠于性生殖干细胞。E．mail：fenglx66@yahoo．com上海交大医学院刘俊岭实验室，具体信息请参见4实验动物与比较医学LaboratoryAni

7、malandComp~atNeMedicine3讨论干细胞的影响也较小，并且有文章研究表明激素并不会影响精原干细胞的增殖，垂体分泌的FSH对睾Pten基因对于动物的发育至关重要，由于丸的作用范围主要集中在A3．A4型的精原细胞【I6】，Pten敲除的胚胎在发育早期致死，所以Pten相关而不是精原干细胞，这也证明激素对本文研究的早的研究成果主要是通过Cre／Loxp系统组织特异性敲期精原干细胞发育并不会产生很大影响。当然，并除获得的D2]。Pten在维持成体干细胞的自我更新和不能排除包括神经在内的全身各组织Pten

8、缺失对睾分化的稳定中起重要作用，而精原干细胞作为一类丸的影响从而带来的精原干细胞的微弱变化。但综十分活跃的成体干细胞涉及Pten相关的研究却非常合考虑特异性，本文作者还是选取了Thy1作为启动少。本研究的主要目的是通过Cre／Loxp系统建立子，同时也在设计新的精原干细胞marker的启动子稳定的精原干细胞中Pten敲除的小鼠病理模型，作获得基因敲除的小鼠来验证本实验所获