青枯菌SRAP—PCR体系的建立与优化-论文.pdf

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1、山西师范大学学报(自然科学版)第27卷第4期JoumalofShanxiNormalUniversityV01．27No．42013年l2月NaturalScienceEditionDec．2013文章编号：1009-4490(2013)04-0069-04青枯菌SRAP—PCR体系的建立与优化智艳平，武喜艳，安瑶瑶，郜刚(山西师范大学生命科学学院，山西临汾041004)摘要：本研究以马铃薯青枯菌P046为试验材料，应用单因素试验法优化SRAP—PCR反应体系，得出重复性好、带型清晰、稳定性强的最佳反应体系：总体积为10

2、，50rig／txL模板DNA0．6txL、10p~mol／L引物0．8wL、TapDNA聚合酶1．0U、10mol／L、dNTPs1．0IxL．该反应体系可用于青枯菌遗传多样性、基因定位与克隆等的研究．关键词：青枯菌；SRAP；体系优化中图分类号：Q7文献标识码：A青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum，俗称青枯菌)引起的毁灭性土传病害，可侵染50多科450多种植物．近年来，随着设施蔬菜的推广和普及，高密度、连作使得青枯病大量发生，严重影响了我国蔬菜的品质和产量．序列相关扩增多态性(Sequ

3、ence．relatedamplifiedpolymorphism，SRAP)是由美国加州大学蔬菜作物系的Li等人．3于2001年提出来的以PCR技术为基础的一种分子标记技术．该技术对基因的开放阅读框ORFs(Openreadingframes)的特定区域进行扩增．引物由上、下游一对引物组成，5’端的前10(或11)个氨基酸为非特异性的填充序列；随后分别是“CCGG”序列对外显子区域进行特异扩增和“AA1Tr”序列对富含AT的内含子区域和启动子区域进行特异扩增．SRAP技术具有操作简单，重复性好，产率中等，成本低廉，结果

4、可靠，共显性标记且易对扩增的目的片段测序等优点．近年来，SRAP技术常用于动物、植物和真菌等真核生物遗传多样性分析4j、作物品种鉴定、遗传图谱构建和基因标记等方面的研究．但是，该技术在原核生物中鲜见报道，而有学者使用AFLP等标记技术研究过青枯菌遗传多样性_8J，但未曾有人使用SRAP技术研究过青枯菌．本实验对青枯菌SRAP—PCR体系进行了优化，以期为后续研究提供参考．1材料与方法1．1材料本实验中，青枯菌P046是由中国农业科学院蔬菜花卉研究所和中国农业科学院植物保护所提供．1．2方法1．2．1基因组DNA提取取菌液

5、750IxL于1．5mL离心管，在用10000r／min的转速离化1min，弃上清；加入283IxLTE缓冲液，震荡混匀；an人15txL10％的SDS和1．5IxL20mg／mL的蛋白酶K，混匀，在37clC下温浴2h，期间每隔15rain上下颠倒离心管一次；加505mol／L的NaC1溶液，混匀，再加40IxLCTAB／NaC1溶液，混匀，收稿日期：2013-09-07基金项目：国家自然基金项目资助(31271774)．作者简介：智艳平(1987一)，女，山西晋中人，山西师范大学生命科学学院硕士研究生，主要从事分子生

6、物学方面的研究．通讯作者：郜刚(1971一)，男，山西临汾人，山西师范大学生命科学学院教授，博士，硕士生导师，主要从事分子生物学方面的研究．_llllcll卜·72·山西师范大学学报(自然科学版)2013正3讨论SRAP是一种基于PCR的DNA分子标记技术，前人多采用该技术进行真核生物的研究，本文经过实验证明：原核生物也可以采用该技术进行研究．原核生物的遗传物质没有细胞核包围，DNA分子直接裸露在细胞质中，容易发生突变；突变点的增多，可以弥补没有内含子和调控序列简单引起的多样性不足的缺点．PCR受诸多因素的影响，包括DN

7、A浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶、dNTPs．前人用正交设计法¨控]和均匀设计法¨来优化PCR体系，在本研究中，根据实验室的经验值，采用单因素试验法进行PCR体系优化，操作简单，简便可行，结果重复性好．本研究得出的最佳反应体系：总体积为l0I，50rig／txL模板DNA0．6IxL、10ixmoL／L引物0．8、聚合酶1．0U、10mol／LdNTPs1．0txL．该体系重复性好、带型清晰、稳定性强，可用于青枯菌遗传多样性、基因定位与克隆等方面的研究．参考文献：1]乔俊卿，陈志谊，刘邮洲，等．茄科作物青枯病研究进展

8、『J]．植物病理学报，2013，(1)：1～10．[2]LiG，QuirosCF．Sequence—relatedamplifiedpolymorphiSIl(SRAP)[J．ANewMarkerSystemBasedonaSimplePCRReaction：ItsApplicationtoMappingandGen