太平洋牡蛎不同组织DNA甲基化的F-MSAP分析-论文.pdf

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1、中国水产科学2014年7月，21(4)：676—683JournalofFisherySciencesofChina研究论文DoI：10．3724／SP．J．1118．2014．00676太平洋牡蛎不同组织DNA甲基化的F．MSAP分析姜群，于红，孔令锋，李琪中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东青岛266003摘要：采用荧光标记的甲基化敏感性扩增多态性(F．MSAP)技术对太平洋牡蛎(Crassostreagigas)的6个组织进行全基因组CCGG位点甲基化水平的检测。结果表明：鳃、闭壳肌、外套膜、唇瓣、性腺、消化盲囊6个组织的甲基化水平分别为

2、：31．77％、36．41％、32．00％、36．47％、32．77％和37．92％。甲基化模式分为全甲基化和半甲基化，在太平洋牡蛎中，全甲基化模式与总体甲基化水平一致，消化盲囊、唇瓣、闭壳肌组织的甲基化水平较高，而鳃、外套膜、性腺组织的甲基化程度较低；半甲基化位点显著少于全甲基化位点，并且不同组织间的半甲基化位点不存在显著性差异，而从全甲基化位点及总甲基化水平分析，不同组织之间甲基化水平差异显著。太平洋牡蛎中存在组织特异性甲基化片段和非组织特异性甲基化片段，但却只在一个或部分个体中出现，没有发现在所有研究个体中都存在的甲基化差异片段，这可能与牡蛎较

3、高的杂合度相关。对实验样品进行的荧光标记的扩增片段长度多态性(F-AFLP)分析发现，样品间的确存在较大的遗传差异，基于以上结果可以推测基因组甲基化水平可能与个体遗传背景相关联。关键词：太平洋牡蛎；基因组；甲基化；F-MSAP中图分类号：$917文献标志码：A文章编号：1005—8737一(2014)04—0676—08表观遗传学是指在DNA序列不发生变化的不同组织发挥相应的生物功能【8，14-15]。然而，DNA情况下产生的可遗传的基因表达改变，DNA甲基甲基化在发育过程中的调控作用在不同物种甚至化是迄今为止研究较为成熟的一种表观遗传修饰不同组织中

4、存在差异，如斑马鱼(DanioFe—形式，在维持染色体结构¨]、基因印记[2]、X染色rio)DNA甲基转移酶基因(Dnmt1)的敲除致使肠体失活[。】疾病[]和肿瘤[]的发生等过程中发挥重等组织不能正常发育，但肝组织却不受影响【l刨；要作用，在生物体的组织发育和分化过程中，同样Warnecke等【17]和Walsh等[181发现在一些组织特异也存在DNA甲基化的调控，目前，在哺乳动物、性基因中，基因表达与甲基化水平之问并无关植物[8-10及低等海洋无脊椎动物¨。中都已发现联。因此分析不同组织之间的甲基化对于理解组织间DNA甲基化差异片段。组织问甲基

5、化的DNA甲基化与发育之间的关系具有重要作用。差异主要分为两种：一种是组织特异性差异指DNA甲基化的检测方法有很多，甲基化敏感的是只有一个组织的甲基化模式与其他所有组织性扩增多态一~(MSAP)技术是目前研究较为成熟不相同；另一种称为非组织特异性差异，是指2的方法之一[9]，由扩增片段长度多态性(AFLP)技个以上的组织甲基化模式与其他组织不相同。组术改进产生，用对CCGG位点胞嘧啶甲基化敏感织特异性基因启动子的高甲基化／去甲基化可以性不同的同裂酶HPaII和MspI代替MseI，可以抑制／激活相关基因转录，调控基因表达，进而使从全基因组水平检测CC

6、GG位点处的DNA甲基收稿日期：2013-09．29；修订B期：2014—01．21．基金项目：国家863计划项1~(2012AA10A405)；国家自然科学基金资助项H(31372524)；国家重点基础研究发展计划(201OcB126406)作者简介：姜群(1987一)，女，博士研究生，专业方向：贝类遗传育种．E—mail：jiangqun1013@163．com通信作者：李琪，教授，博士生导师，研究方向：贝类遗传育种．Tel：0532-82031622；E-mail：qili66@ouc．edu．Oil第4期姜群等：太平洋牡蛎不同组织DNA甲基化

7、的F．MSAP分析677化状态。HPaII和MspI都能识别并切割CCGG的修改，用2U的EcoRI和2U的HpaII／MspI进序列，但是对胞嘧啶甲基化的敏感性不同，HPaII行酶切，总体积为10L。酶切产物在T4连接酶不能酶切双链都存在甲基化的位点，而MspI不的作用下与接头连接，l0倍稀释后进行预扩增。能识别外侧甲基化胞嘧啶，通过条带在两种酶切表1F．MSAP中所用的引物与接头序列下的出现情况可以判断该位点的甲基化状态。荧Tab．1Sequenceofadaptersandprimersusedfor光标记的甲基化敏感性扩增多态性(F—MSAP

8、)技F-MSAPanalysis术【l9J在MSAP的基础上对选择性扩增引物进行了接头／引物序列(5'-3)