稳定表达绵羊肺腺瘤病毒受体Hyal-2蛋白细胞系的建立-论文.pdf

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1、第36卷第3期中国预防兽医学报Vo1．36．NO．32014年3月ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineMar．2O14doi：10．3969~．issn．1008-0589．2014．03．05稳定表达绵羊肺腺瘤病毒受体Hyal一2蛋白细胞系的建立刘畅，-，李磊，-，于立新，一，么宏强，-，周建华，马学恩，(1．内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018；2．农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特010018；3．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001)

2、摘要：为构建稳定表达绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)受体透明质酸酶．2(Hya1．2)的NIH3T3细胞系，本研究采用RT．PCR方法从绵羊瘤胃组织总RNA中扩增Hya1．2的cDNA，并引入标签多肽HA序列和限制性内切酶位点，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3．1(+)中，构建重组质粒pcDNA．Hyal2．HA。将该重组质粒转染NIH3T3细胞，并利用G418筛选、纯化，获得了稳定表达JSRV受体蛋白Hya1．2的NIH3T3细胞系。qPCR、间接免疫荧光及westernblot检测结果表明，该细胞系在传代至15代后，Hyal2一HA在NIH3T

3、3细胞中仍然能够稳定表达，并且主要分布于细胞膜上。JSRV囊膜蛋白诱导细胞转化试验显示，该蛋白的瞬时表达可以导致NIH3T3细胞出现转化聚积灶，但失去了对稳定表达绵羊Hya1．2蛋白NIH3T3细胞系的诱导转化作用，其作用机制尚待阐明。该细胞系的建立为进一步研究JSRV与其受体的相互作用致瘤机制奠定了基础。关键词：绵羊肺腺瘤病毒；透明质酸酶．2；真核表达；NIH3T3细胞系中图分类号：$852．65文献标识码：A文章编号：1008—0589(2014)03．0187．05Developmentofacelllinestablyexpressin

4、gJaagsiekteretrovirusreceptorHyal一2proteinLIUChang。，，LILei，，YULi—xin，，YAOHong-qiang，，ZHOUJian-hua，MAXue-en，’(1．CollegeofVeterinaryScience，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Huhhot010018，China；2．KeyLaboratoryofClinicalDiagnosisandTreatmentTechnologyinAnimalDisease，Ministryof

5、Agriculture，Huhhot010018，China；3．HarbinVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China)Abstract：TostudytherelationshipbetweenJaagsiekteretrovirus(JSRV)andreceptorofJSRV，aNⅢ3T3celllineexpressingsheepreceptorprotein(Hyal一2)ofJSRVwasestablish

6、ed．TheHyal一2cDNAwasamplifiedwithallHAtagbyRT—PCRandclonedintotheeukaryotieexpressingvectorpcDNA3．1(+)．TheresultingrecombinantplasmidwastransfectedintoNm3T3cells．AcelllinestablyexpressingHyal2一HA，namedasNm3T3-Hyal2-HA，wasscreenedandcolony-purifiedunderthedrugselectionofG418．T

7、heexpressionofHyal2一HAwasconfirmedbyqPCR，indirectimmunofluorescenceassayandwesternblot．ResultsindicatedthattherecombinantHyal2一HAwascorrectlyandefectivelyexpressedintheNm3T3-Hyal2-HAcelllineandwasmostlylocatedinthemembrane．ThetransientexpressionofJSRVenvelopeprotein(Env)in3T

8、3ceilsresultedinthemultipleformationoftransformedcellcoloniesbutfailedtoind