稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞系的建立.pdf

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1、第37卷第6期中国预防兽医学报Vo1．37．No．62015年6月ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineJun．2015doi：10．39698．issn．1008-0589．2015．06．08稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK一21细胞系的建立张永宁，吴绍强，宋姗姗，董宣，林祥梅(1．中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所，北京100029；2．山东农业大学动物医学学院，山东泰安271018)摘要：为建立稳定表达施马伦贝格病毒(SBv)核衣壳(N)蛋白的BHK．21细胞系，本研究在SBV-N蛋白编码基因的c端加入6个组氨酸(6x

2、His)标签，将其克隆至慢病毒载体pLVEGFP．c中构建重组慢病毒质粒pLV．EGFP—SBV-N，将其与慢病毒包装质粒pHelper1．0和pHelper2．0共转染HEK-293T细胞，包装表达SBV-N蛋白的慢病毒。将重组慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染BHK．21细胞，采用嘌呤霉素(Puromycin)法和细胞有限稀释法筛选出一株稳定表达SBV-N蛋白的BHK．21细胞系，命名为BHK一21．EGFP．SBV．N。间接免疫荧光试验进一步表明，该细胞系能够被SBV抗体阳性动物血清和特异性单克隆抗体2C8识别。稳定表迭SBV-N蛋白的BHK-21细胞系的建立，为S

3、BV血清学检测方法的建立提供材料。关键词：施马伦贝格病毒；核衣壳蛋白；BHK．21细胞；慢病毒载体中图分类号：$852．65文献标识码：A文章编号：1008．0589(2015)06．0438．06GenerationofaBHK一21celllinestablyexpressingSchmallenbergvirusnucleocapsidproteinZHANGYong—ning，WUShao—qiang，SONGShan—shan，DONGXuan，LINXiang—mei(1．InstituteofAnimalQuarantine，ChineseAcademyofInspect

4、ionandQuarantine，Beijing100029，China；2．CollegeofVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)Abstract：Schmallenbergvirus(SBV)isanewlyemergedorthobunyavimsthatinfectsbothdomesticandwildanimals．Thenucleocapsid(N)proteinofSBVhasbeenextensivelyusedforthemolecularandserologica

5、ldetectionofSBVinfection．Inthisstudy，theSBV-NgenewithaninsertedcodingsequenceforaC—terminalhexahistidine(6xHis)tagwasclonedintothelentivirusvectorpLV—EGFP—C．Theresultingplasmid，pLV-EGFP—SBV—N，wasthenusedtoCO-transfectHEK一293TcellstogetherwithpackagingplasmidspHelper1．0andpHelper2．0forpackagingre

6、combinantlentiviruses．ThegeneratedlentivimseswerethenutilizedtotransduceBHK-21cellsinthepresenceofpolybrene．AstableBHK-21cellline，BHK一21一EGFP-SBV-N，constitutivelyexpressingtheSBV—Nproteinwaspreparedaftercontinuousselectionwithpuromycinandpurificationbythelimitingdilutionmethod．Inaddition，indirec

7、timmunofiuorescenceassaysfurtherdemonstratedthattheestablishedcelllinereactedpositivelywithSBVantiseraandanSBV-specificmonoclonalantibody．ThesuccessfulpreparationofBHK-21-EGFP—SBV—Nprovidesavaluablematerialthatcouldbeapplied